創傷性骨髓炎骨缺損動物模型構建的研究進展

曾慶亮 丁海

近年來隨著創傷患者的增多，創傷性骨髓炎的患者也逐漸增多，如開放性骨折直接污染，或骨折手術，特別是內固定術后出現的骨髓炎，增加了骨折術后嚴重并發癥—感染的發生。尤其是金屬內固定植入后的感染，常導致金屬內固定的取出、擴大清創、再次植入及骨不愈合等嚴重后果[1～3]。該疾病的病因、發展及治療是現在骨科研究的熱點。近年來，人工生物材料及生物載體系統的產生及研究，為治療創傷性骨髓炎骨缺損帶來了希望[4]。隨著創傷性骨髓炎骨缺損動物模型的深入研究，創傷性骨髓炎骨缺損動物模型的建立能夠為人工生物材料及生物載體系統的研究提供有效的方法。目前創傷性骨髓炎骨缺損模型是利用創傷后感染形成骨髓炎的方法來構建創傷后感染骨缺損模型[5～7]。主要步驟包括創傷、接種細菌（種類和濃度）、動物的選擇、制造骨缺損（部位與大小），模型構建后骨髓炎指標的檢測及動物的護理等。本研究通過查閱分析大量關于骨髓炎骨缺損模型構建的最新研究，以對此作出展望。

1　創傷性骨髓炎骨缺損動物模型構建的細菌種類

1.1金黃色葡萄球菌 金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus，SA）是骨髓炎最常見的致病菌[8,9]。因此在創傷性骨髓炎骨缺損動物模型的構建中以SA作為首選。張小磊等[10]用22只新西蘭兔，于下頜骨體外側近正中聯合處開骨窗注入魚肝油酸鈉和5×108CFU/ml SA（ATCC29253），6周后全部出現骨質破壞、骨膜反應、軟組織炎癥等骨髓炎表現。唐輝[11]等利用3mm克氏針在新西蘭兔脛骨近端開約0.5cm×0.5cm骨窗，并注入濃度為6×105CFU/ml SA（ATCC29213）懸浮液和魚肝油酸鈉，3周后出現骨質破壞、骨膜反應、軟組織炎癥等骨感染表現。在兔骨髓炎骨缺損的構建中，還有其他因素如細菌濃度、建模部位、血供等因素影響模型構建的成功率。Chen[12]等在大鼠股骨制造6mm骨缺損后，接種1×104CFU/ml的金黃色葡萄球菌，2個月后再接種1×104CFU/ml，較好地形成節段性骨缺損感染模型且不影響固定裝置的穩定性。Lindsey 等[5]研究發現，大鼠股骨接種1×102CFU/ml SA 即能達到90%以上的動物出現骨髓炎癥狀。Williams等[13]利用模擬羊脛骨近端開放骨折，同時使用涂有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 （MRSA）生物膜接骨板作為內固定建立模型。但目前多數研究表明[14，15]使用SA作為感染菌種，骨髓炎動物模型均建模成功。

1.2銅綠假單胞桿菌和大腸埃希菌 研究表明除SA外，銅綠假單胞桿菌和大腸埃希菌感染也會導致創傷性骨髓炎[8，9]。對于銅綠假單胞桿菌及大腸埃希菌是否能導致骨髓炎，有些學者做了一些研究，如Kanellakopoulou 等[16]將銅綠假單胞菌接種在36 只新西蘭大白兔脛骨上段，14d后全部動物出現局部軟組織腫脹體征，但49d后，其中有11只未出現明顯的骨膜反應、骨破壞、死骨形成、軟組織腫脹等骨感染表現，余25只出現骨破壞、死骨形成、軟組織腫脹和死腔竇道流膿表現，成功率為69.4%。該研究表明銅綠假單胞菌可以誘導產生創傷性骨髓炎模型。但接種銅綠假單胞菌的適宜濃度及接種方式未明確指出，還有待研究，成功率也不高。Passl等[17]將7只豚鼠用無菌電鋸截斷股骨后接種1×105CFU/ml的大腸埃希菌，28d后7只豚鼠均出現明顯的骨膜反應、骨破壞、死骨形成、軟組織腫脹表現，90d后有6只豚鼠細菌培養檢查出現陰性，只有1 只豚鼠細菌培養出大腸埃希菌和銅綠假單胞菌混合菌落，成功率為14.3%，可見大腸埃希菌誘導產生創傷性骨髓炎骨缺損模型成功率并不高。大腸埃希菌感染可能與患者自身有關，創傷可以導致胃腸道應激反應，使腸道水腫從而導致腸道壁通透性增加，再加上細菌產物導致的局部炎癥反應、內毒素和免疫微環境變化等可以產生全身及局部反應，作用于腸道可以使大腸埃希菌穿過腸道進入感染部位，具有一定的自限性，但是局部炎癥反應和炎癥介質的作用可使其他細菌（如SA）的侵襲性增強繼而出現混合感染。

1.3其他細菌 除此以外，研究中用到的細菌還有厭氧菌及鮑曼不動桿菌。霍茜瑜等[18]用浸有鮑曼不動桿菌和金黃色葡萄球菌的鋼針分別插入小鼠脛骨干骺端，11d后小鼠均出現脛骨周圍軟組織密度增高、骨膜增生，骨破壞等表現，進一步研究發現鮑曼不動桿菌實驗組的骨髓炎嚴重程度較金黃色葡萄球菌對照組輕，本方法成功建立了由鮑曼不動桿菌引起的骨髓炎動物模型。但其致骨髓炎效果不強，故很少采用。

2　接種細菌的方式與濃度

骨髓炎動物模型按照細菌接種的途徑分為：靜脈注射模型、局部注射（接種）模型、生物載藥系統模型[19]。Rodet[20]通過直接靜脈注射SA到兔體內建立骨髓炎模型，但是實驗最后發現該方法易導致實驗動物的死亡及難以構建出骨髓炎模型，故靜脈注射構建骨髓炎動物模型比較困難。另一種方法為克氏針骨髓腔鉆孔接種，Norden[21]通過研究菌落接種發現單獨應用魚肝油酸鈉或葡萄球菌在14d或60d時無明顯骨髓炎癥狀，而同時應用魚肝油酸鈉和葡萄球菌在60d和180d時90%的動物表現出骨髓炎癥狀，故同時接種細菌及硬化劑封閉是構建骨髓炎動物模型成功的重要條件。Horn 等[22]認為若想達到100%的感染率，注入的細菌濃度應在106～108CFU/ml之間。但是有些研究[23]發現如果接種細菌濃度過高，容易導致動物死亡。而Lindsey等[5]研究發現，大鼠股骨接種細菌量在1×102CFU/ml的SA即能達到90%以上的動物出現骨髓炎癥狀。說明接種細菌濃度對骨髓炎骨缺損動物模型的構建成功率的影響較小。該研究認為細菌通過釋放一些改變動物體內局部微環境的物質來影響接種細菌的增殖，繼而對骨髓炎模型的構建產生影響。故有關于接種細菌懸液的濃度對骨髓炎動物缺損模型的構建是否有影響還需進一步研究。

3　動物種類

在構建創傷后骨髓炎骨缺損動物模型時，模型動物在解剖學和疾病發展規律上應與人類相似，常用的動物有新西蘭兔、鼠，狗、豬、羊等較少用。一些研究認為大鼠比較適合用于感染性骨缺損的研究[24]，因為大鼠具有成本低、耐受廣譜抗生素治療和支持較少內固定的優點。但是大鼠具有一定的攻擊性，手術操作較為精細，不容易掌握，其次，作為小型動物，解剖結構及疾病發展規律與人類有一定相差，故應合理選取大鼠動物模型。兔、犬、豬等動物骨架偏大，手術操作較為容易，解剖結構及疾病發展規律與人類相似，可以作為理想的實驗動物[25]。但犬和豬實驗成本較高，不易飼養，且犬和豬具有攻擊性，故不能作為普通實驗動物使用，因此兔是比較常用的骨缺損模型動物。新西蘭大白兔大小合適、性格溫順、易于得到，解剖結構與人體類似，手術操作方便，適宜作為骨髓炎骨缺損研究的模型動物[26]。此外，兔可作為創傷性骨髓炎骨缺損的研究部位較多，常用的部位有：顱骨、下頜骨、橈骨、股骨干、脛骨等。每個部位都有著自己的優缺點[27，28]。

4　造模部位及骨缺損尺寸的選擇

構建骨髓炎骨缺損動物模型時應考慮造模部位。骨缺損自我修復能力受多種因素影響：如缺損是否超過臨界值、缺損部位血供是否完善、動物的年齡及營養狀態等[29]。非負重骨常用的有橈骨、下頜骨、顱骨等，負重骨有股骨、脛骨等[30，31]。由于臨床中常見的骨缺損多發生在負重骨，故造模部位多選在負重骨。臨界性骨缺損（critical size defect，CSD）是動物模型的重要參數，它是指動物不能自我修復愈合的最小骨缺損值，在不同的部位最小骨缺損值不同，Schmitz等[32]將CSD進行量化，認為骨缺損大小為其骨干直徑1.5～2.5 倍長度時可以導致骨不愈合。但這種方法并不適用于骨髓炎所致骨缺損的量化研究，因為除骨缺損臨界值外，影響骨髓炎骨缺損的因素還包括接種濃度、接種細菌類別、接種方式、糖尿病、免疫力低下等因素。因此在構建和研究骨髓炎骨缺損模型時需要充分考慮上述因素。即使消除多數混雜因素也難以保證造模的差異性很小，故骨髓炎骨缺損的部位和大小難以固定，后續研究更需要探究可以用于量化的指標。

5　創傷性骨髓炎骨缺損模型的檢測

創傷性骨髓炎骨缺損模型構建完成后，建模是否成功要依據一些方法進行檢測。常用的檢測方法包括大體觀察、生化指標、細胞學、影像學、微生物學和組織學結果[33]。①大體觀察：骨缺損部位是否有紅腫滲出、局部皮溫增高、竇道形成等；②生化指標：C 反應蛋白（CRP）增高、紅細胞沉降率（ESR）加快和白細胞計數升高，中性粒細胞比值增大可作為創傷后骨髓炎骨缺損動物模型構建后的檢測；③局部分層穿刺：對早期的診斷有重要價值。穿刺液涂片檢查有膿細胞或細菌則可明確診斷；④X線檢查：有骨破壞、骨膜反應、死骨形成等表現；⑤近年來隨著核醫學的興起，顯微ECT-CT 開始用于骨髓炎骨缺損模型的術后檢測，其優點是能早期發現骨感染，但其檢查麻煩及對診斷骨髓炎的特異性不高；⑥MRI：該檢查對病灶敏感性高、特異性強，T2像炎癥病變信號加強，檢查便利，對早期診斷有一定的價值。在構建骨髓炎骨缺損動物模型后還可以通過手術活檢的辦法來確定類別。

6　小結與展望

隨著骨髓炎骨缺損動物模型構建的大量研究，發現有多種方法可以構建骨髓炎骨缺損動物模型，但是提高建模的成功率需注意動物種類、建模部位、注入細菌方式和適宜濃度的選擇，故如何更好地構建骨髓炎骨缺損的動物模型仍需要更深入的研究。今后研究需要注意以下問題：①創傷性感染與骨缺損的手術步驟的先后順序；②大型動物解剖結構及疾病發展過程與人類相似，故應克服大型動物建模的缺點，更多地構建大型動物的模型；③完善創傷性骨髓炎骨缺損量化指標；④隨著創傷后感染骨缺損治療方法的深入研究，能否實現多種途徑聯合應用，找出更簡便、有效的方法。