不同濃度TTC在微生物檢測培養基中的應用

□ 李學興 石 琳 梁 偉 云南省玉溪市食品藥品檢驗所

TTC化學名為2.3.5-氯化三苯基四氮唑，別名氯化三苯四氮唑，在微生物檢驗中起染色作用，其原理是TTC和活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶反應，生成紅色的還原產物，使菌落變紅色，便于菌落計數。在微生物檢驗工作中,菌落總數測定是用于檢驗樣品被污染程度的一項基本指標。現行《中國藥典》[1]藥品微生物學檢測方法以胰酪大豆胨瓊脂培養基培養技術需氧菌總數（包括真菌菌落數）；食品檢驗國家標準中食品微生物學檢驗的菌落總數測定［2］采用平板計數瓊脂培養基培養菌落總數；化妝品國家標準《化妝品安全技術規范》（2015年版）［3］中介紹：在每100 mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基中可加入0.5%氯化三苯四氮唑(TTC)溶液1 mL用于菌落總數的測定的實驗方法中。在實驗過程中有時候因為被檢驗樣品中含有沉渣（藥品藥渣、食品中的碎屑、化妝品中的顆粒等），其形態類似細菌或覆蓋菌落給菌落計數工作造成一定的困難。為了防止細菌的蔓延生長和便于計數，有時可以加入適量的TTC進行染色從而方便菌落計數，提高菌落計數的準確性。《藥品衛生檢驗方法》（1990年版）［4］指出，一般是1%TTC加到培養基后的最終濃度為0．001%。但實際工作中，常常會碰到一些不正確的做法。目前，有些檢驗人員在進行微生物學檢測時，培養基中加入過量的TTC，這樣計數所得的菌落數結果，往往是偏少或不準確。為了解含不同濃度TTC培養基對微生物菌落生長的抑制性，本文對6種菌株加入6個不同濃度的TTC培養基［5］及不加TTC培養基的菌落生長結果進行了考察研究。

1 試驗材料

1.1 儀器設備

HRLM-80型立式蒸汽滅菌器（青島海爾特種電器有限公司）、SPX-150生化培養箱（慧科電子有限公司）、BP1502型電子天平（梅特勒—托利多儀器有限公司）、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）。

1.2 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號3104855）、0.5%無菌TTC溶液（批號6104032），均由廣東環凱微生物科技有限公司生產。

1.2.1 培養基制備

胰酪大豆胨瓊脂培養基按照使用說明用蒸餾水配制后采用濕熱滅菌處理恒溫待用，參考孔秀珍《在化妝品菌落測定中應用TTC的探討》［6］，臨用前用帶無菌槍頭的移液槍將0.5%無菌TTC加入恒溫45 ℃的胰酪大豆胨瓊脂培養基中分別制成每100 mL培養基中含TTC為 10.0、5.0、2.5、1.5、1.0、0.5 mg 6個不同濃度。

1.3 菌株及來源

大腸埃希菌[CMCC（B）44102〕第3代；乙型副傷寒沙門菌[CMCC（B）50 094]第3代；枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63 501]第3代；白色念珠菌[CMCC（F）98 001]第3代；黑曲霉[CMCC（F）98 003]第3代；金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]第3代。以上菌種均來自中國食品藥品檢定研究院，所用菌液在實驗前取新鮮培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液洗脫為菌懸液并用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至最終濃度為每1 mL中含菌落數為50～100 CFU/mL。

2 試驗方法

按無菌操作分別用無菌吸管取經稀釋含菌落數為50～100 CFU/mL的大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌各1 mL注入無菌平皿，平行制備2個平皿（結果取平均值），然后分別傾注含各不同濃度TTC胰酪大豆胨瓊脂培養基15～20 mL，混勻，待凝固后35℃倒置培養72 h計數結果（培養期間逐日觀察計數），計數結果見表1。

3 結果分析

實驗結果顯示，通過不同濃度的TTC胰酪大豆胨瓊脂培養基與不加TTC胰酪大豆胨瓊脂培養基計數結果對比，在6株供試驗的菌株（6株菌株性質分別為：2株革蘭氏陽性菌代表、2株革蘭氏陰性菌代表、1株真菌代表、1株霉菌代表，其中乙型副傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌為食品衛生檢驗項目的常規致病菌代表。）加入每100 mL培養基10.0、5.0、2.5、1.5、1.0、0.5 mg 6個不同濃度TTC胰酪大豆胨瓊脂培養基培養后，大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門氏菌、黑曲霉菌對各個濃度TTC均表現為不敏感；金黃色葡萄球菌在TTC濃度分別為5.0 mg和10.0 mg時表現為生長抑制、生長緩慢，且菌落小如針尖培養至72 h勉強可計數，金黃色葡萄球菌的其他TTC濃度在培養24 h時候菌落即生長旺盛便于計數；枯草芽孢桿菌、白色念珠菌在TTC濃度分別為5.0 mg時表現為有輕微抑制作用,10.0 mg時枯草芽孢桿菌表現為抑制但稍有菌落生長，白色念珠菌表現為完全抑制生長。本次試驗中發現，培養基中加高濃度TTC對此次實驗菌株的革蘭氏陽性菌表現顯著抑制，對革蘭氏陰性菌表現無抑制，且TTC濃度越高,抑制作用越明顯。每100 mL培養基含TTC濃度在0.5 mg及以下時菌落不顯紅色，TTC已不能起染色作用，因此也失去了其使用價值。本次實驗證明加入培養基TTC適宜濃度為1.0～2.5 mg/100 mL，不應達5.0 mg/100 mL（化妝品安全技術規范菌落總數測定中每100 mL卵磷脂吐溫80營養瓊脂培養基中加入0.5%TTC溶液1 mL達到5 mg/100 mL的濃度有待考究適宜性）及以上濃度，加入過高濃度的TTC培養基檢測微生物會使樣品中微生物菌落受到抑制，甚至一定濃度的TTC會導致某些菌落種類不生長的情況，從而影響樣品微生物計數結果的真實性和判斷實驗的準確性。

表1 不同濃度TTC培養基各菌落生長情況表

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].中國醫藥科技出版社 ,2015：81-85.

[2]國家衛生和計劃生育委員會,國家食品藥品監督管理總局.GB 4789.2-2016食品微生物學檢驗 菌落總數測定[S].北京：中國標準出版社,2017.

[3]國家食品藥品監督管理總局.化妝品安全技術規范[Z].2015：471-474.

[4]中華人民共和國衛生部.藥品衛生檢驗方法[Z].1990：10-11.

[5][6]孔秀珍.程潔萍.在化妝品菌落總數測定中應用TTC的探討[J].中國衛生檢驗雜志,2006(7)：831-832