禽偏肺病毒分子生物學診斷方法研究進展*

于新友，李天芝

(山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600)

禽偏肺病毒(Avianmetapneumovirus，aMPV)屬于副黏病毒科、偏肺病毒屬[1]，可感染火雞、雞、雉雞、珍珠雞、鴕鳥等多種禽類，引起禽類呼吸道癥狀、頭部腫脹和產蛋率下降等。火雞鼻氣管炎、禽鼻氣管炎和雞腫頭綜合征等多種疾病都因aMPV感染而發生，這類疾病也成為禽偏肺病毒病。主要通過水平方式傳播，尚未有垂直傳播的證據。根據抗原性和基因特異性，aMPV分為 A型、B型、C型、D型4種型[2]，其中A型、B型在世界范圍廣泛流行，C型、D型在局部地區流行。各日齡禽類均可感染，4～7周齡發病率高。該病傳染性強，傳播迅速，病程可持續2～3周，單獨感染時僅出現一過性輕微呼吸道癥狀，死亡率不超過5%，當混感或繼發其它疾病時，死亡率可高達40%[3]，給養禽業造成了嚴重的經濟損失[4]。

1978年，南非共和國首次報道了aMPV引起的火雞鼻氣管炎，并于1989年成功分離到病毒，隨后英國、美國、以色列、法國、日本等國均有報道。1998年我國大陸學者沈瑞忠首次從腫頭綜合征肉雞中分離了aMPV[5]，目前已證實aMPV在我國雞群感染率高[6]，包括A型、B型、C型3種血清型。aMPV病毒粒子可呈橢圓形、圓形等多種形狀[7]，直徑大小80～200nm，有囊膜；表面有纖突，長約 13～14nm，不能凝集紅細胞；對乙醚敏感，不耐熱，56℃ 30min可滅活，pH值為3～9時病毒可保持穩定，當存在有機物時，病毒外界抵抗力強，20℃條件下家禽墊料中病毒可存活4周，37℃時可存活長達2周，常用的消毒劑如過氧乙酸、2%的氫氧化鈉溶液、戊二醛、2%的甲醛溶液均能有效殺滅病毒。aMPV核酸為不分節段、單股負鏈RNA，基因組長度約為14kb，共編碼8種結構蛋白，從 3′端到 5′端依次為核蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、第二基質蛋白（M2）、小疏水蛋白（SH）、糖蛋白（G）和聚合酶蛋白（L）。本文就近年來aMPV的分子核酸探針法、常規RT-PCR 法、套式RT-PCR法、熒光RT-PCR方法、環介導等溫擴增技術等5種生物學診斷方法研究進展進行綜述，以期為禽偏肺病的快速診斷和防控提供參考。

1 核酸探針法

核酸探針是利用核苷酸堿基順序互補的原理，用特異的基因探針與被測定的靶序列互補，以檢測被測靶序列的技術，可定性或定量檢測特異RNA或DNA序列，它具有操作簡單、結果易于判定等優點，適合在基層推廣使用。陳琳等[8]根據GenBank中已經發表的B亞型aMPVF基因的保守序列設計并合成1對引物，利用RT-PCR擴增出1條與目的片段大小一致的725bp基因片段，回收、純化PCR產物，用地高辛標記，制備出地高辛標記的aMPV核酸探針。特異性檢測結果表明，該探針能與aMPV核酸發生特異性雜交，而與H9N2亞型 AIV、NDV、IBV、ORT 和 E.coil的核酸雜交反應均為陰性，敏感性檢測結果表明，該探針對aMPV的最低檢出量為5pg。

2 常規RT-PCR法

RT-PCR是以病毒的RNA為模板進行反轉錄，再以PCR進行核酸擴增來檢測病毒的方法，較病毒分離鑒定等傳統的方法的檢測速度更快、靈敏度更高，在動物疾病診斷上得到了廣泛的應用。陳琳等[9]根據GenBank中已經發表的B亞型aMPVF基因的保守序列設計并合成1對引物，利用RT-PCR可以擴增出1條725bp的片段，進行特異性試驗和敏感性試驗，建立了aMPV病的RT-PCR檢測方法。特異性試驗表明，建立的RTPCR檢測方法能夠從aMPV疫苗毒株VIR115-B中擴增到725bp的特異性片段，而對H9N2亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒的擴增結果均為陰性，敏感性試驗表明，該方法最低檢出量的cDNA質量濃度為1.45μg/L，對山東省492份病料進行檢測，陽性檢出率為43.09%(212/492)，隨機挑取11份進行克隆測序及序列分析，結果顯示所擴增到的陽性產物均為B亞型的aMPV。

3 套式RT-PCR法

套式RT-PCR，又稱巢式RT-PCR。采用兩對引物擴增目的基因片段，第2對引物在第1對引物的內部設計，以第1對引物的擴增產物為模板進行再次擴增，經兩輪擴增，保證的擴增產物的特異性，提高了PCR檢測的敏感性。薛聰等[10]根據GenBank發布的B亞型aMPVF基因的保守序列設計2對引物，建立了一種適用于B亞型aMPV的逆轉錄套式PCR檢測方法。此方法具有高度特異性和敏感性，以H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒作為模板進行擴增，結果均為陰性。經檢測，該方法第1次 PCR擴增的敏感性為107copies/μl，第2次擴增的敏感性為102copies/μl，第2次擴增敏感性比第1次高105倍。

4 熒光RT-PCR方法

熒光RT-PCR是在常規RT-PCR技術基礎上發展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術，它融匯了傳統PCR技術靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術的高敏感性和高精確定量的優點，檢測速度快、敏感高，可直接觀察擴增結果，不需要后續電泳檢測擴增產物，減少了對環境氣溶膠污染的可能，避免了假陽性結果。據信號基團的不同，實時熒光定量 PCR可以分為染料法和探針法兩種。王麗榮等[11]根據GenBank登錄的B亞型aMPVF基因序列設計1對特異性引物，建立SYBRGreenⅠ熒光定量PCR標準曲線，并做敏感性試驗、特異性試驗和重復性試驗。結果表明，標準曲線循環閾值與模板濃度呈良好的線性關系，產物 T值在 83.0～83.7℃之間，靈敏度為 7.9×102拷貝/μl，特異性和重復性較好。劉佳佳等[12]根據GenBank中C型aMPVP基因序列，設計出一對特異性引物和Taqman探針，建立了C型aMPV Taqman探針熒光定量PCR方法。結果表明，該方法只對C型aMPV檢測為陽性，具有良好的特異性，能夠檢測到(3.63×102)拷貝數，具有良好的敏感性，建立的標準曲線斜率為-3.312，截距為44.66，相關系數為R2=0.999，循環閾值和模板拷貝數具有良好的相關性，組內及組間重復性好。陳基明等[13]根據GenBank發表的aMPVF基因序列，設計一對特異性引物，建立C亞型aMPV的SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR方法。對該反應體系進行條件優化，建立了標準曲線，并進行特異性、敏感性及重復性試驗，然后將建立的方法應用于臨床樣品和攻毒樣品的檢測。結果顯示：標準曲線循環閾值與模板濃度呈現良好的線性關系，建立的方法只能檢測出C亞型aMPV，最低可以檢測到0.8×101拷貝/μl的核酸模板，重復性試驗的變異系數小于4%。應用建立的方法對43份臨床樣品檢測，結果顯示均為陰性，對42份35日齡SPF雞人工感染后1～21d的氣管和肺臟樣品進行檢測，結果顯示攻毒樣品均為陽性。

5 環介導等溫擴增技術

環介導等溫擴增 (LAMP)方法是日本學者Notomi等發明的一種新的適用于基因診斷的恒溫核酸擴增技術，不需要復雜的儀器設備，一臺水浴鍋或恒溫箱就能實現反應，結果可通過肉眼觀察白色渾濁或綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，具有靈敏度高、操作簡單、反應時間短、臨床使用不需要特殊的儀器等優點，特別適合在現場和基層部門應用。鞠小軍等[14]針對B亞型aMPVF基因的特異性引物，并從反應時間、溫度、各組分濃度等方面優化了反應體系和反應條件，建立了B亞型aMPV逆轉錄環介導等溫核酸擴增 (RT-LAMP)快速檢測方法。該方法能夠在63℃條件下1h內實現B亞型aMPVF基因片段的特異性擴增，與其他病毒，如H9N2亞型禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)、傳染性法氏囊病病毒(IBDV)等的核酸無交叉反應。反應結果可直接用肉眼判斷。對質粒DNA的最小檢測量為1×102拷貝/μl。

6 小結

疾病的正確診斷是進行有效防控的前提和基礎，隨著規模化養殖的發展，臨床上的禽病變得越來越復雜，老病新發和疾病混感現象增加，很難通過臨床表現和眼觀病變診斷疾病，需要通過實驗進行精準診斷，從而及時采取有效的措施，降低損失。aMPV病雖然在火雞上存在幾十年了，也是對火雞危害最嚴重的幾種疾病之一，但在雞上的研究并不多，主要引起雞腫頭綜合征和減蛋下降，近年來引起關注。由于病毒分離培養難度大，血清學診斷不能判定是否現癥感染，且易混感其它疾病的特點，更增加了疾病的診斷難度，當前主要依靠分子生物診斷進行確診，雖然aMPV分子生物學檢測方法多樣，但各有利弊，常規RT-PCR方法雖然檢測速度快、特異性強，但不能定量，且檢測敏感性不高。熒光RT-PCR方法雖然克服了常規RT-PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，不適合基層應用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應用，但靈敏度太高，易出現假陽性結果。

隨著技術的不斷發展，已經出現了免核酸提取熒光PCR擴增技術、便攜式熒光PCR儀器及除模板外PCR組份凍干保存技術，如能應用于aMPV分子檢測，必將開發出更方便、快捷、成本更低的病毒分子檢測技術，方面疾病快速確診，從而更好做好禽偏肺病毒病的防控工作。針對該病尚無有效的治療方法，國內也無疫苗預防，確診后只能對癥治療，從生物安全方面進行控制，加強飼養管理，提高禽類機體抗病力。禽舍定期通風、降低氨氣濃度、減少飼養密度、減少應激以降低禽偏肺病毒發病率和病情的嚴重程度。