肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測在涂陰肺結核早期診斷中的應用價值

鐘劍峰 童涌 童照威 宋群 王偉洪

近年來隨著社會老齡化以及免疫抑制劑的過度使用，結核病發病有增多趨勢[1]。根據2015年中國傳染病網絡直報系統，報告肺結核患者86.4萬例；其中痰涂片陰性（涂陰）患者62萬例，占總發病數的71.8%[2]。近年來，隨著結核桿菌利福平耐藥基因（Xpert MTB/RIF）檢測技術的應用，痰涂片陽性（涂陽）及利福平耐藥肺結核的早期診斷與治療水平有了很大的提高，但多數涂陰肺結核患者仍不能得到及時的診斷與治療[3-4]。因此，提高及時診斷與治療涂陰肺結核患者的水平，對有效控制結核病有著舉足輕重的作用。大部分涂陰肺結核患者的臨床癥狀不明顯，痰量少，所以無法獲得合格的痰標本，而通過支氣管鏡留取肺泡灌洗液進行檢測是一個很好的方法。本文通過對涂陰肺結核患者進行氣管鏡檢查，留取肺泡灌洗液進行抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養及藥敏試驗、Xpert MTB/RIF檢測，以探討肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測在涂陰肺結核早期診斷中的應用價值。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2014年7月至2016年6月本院收住的213例患者為研究對象，所有患者3次痰找抗酸桿菌（即時痰、夜間痰、晨痰）均為陰性。均行支氣管鏡檢查，最終診斷為涂陰肺結核［參照《中國結核病防治規劃實施工作指南（2008版）》涂陰肺結核的診斷標準］157例為觀察組；經進一步氣管鏡、肺穿刺活檢及診斷性抗炎治療等隨訪觀察排除結核病的56例患者為對照組。觀察組中男 97 例，女 60 例；年齡 17～80（51.7±4.6）歲。對照組中男 37 例，女 19 例；年齡 28～82（49.3±3.7）歲。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。所有患者簽署支氣管鏡檢查知情同意書，行支氣管鏡采集標本前均未予抗結核治療。

1.2 儀器和試劑 抗酸桿菌涂片染色液（4×250ml，批號：YZB/粵珠0063-2013）購自珠海貝索生物技術有限公司；全自動分枝桿菌培養鑒定藥敏系統（型號：BACTEC MGIT 960）及其配套試劑（批號：YZB/USA 0069-2015）均購自美國BD公司；Xpert MTB/RIF檢測設備（型號：GeneXpert MTB/RIF）及其試劑盒（批號：YZB/SWE 0773-2014）購自美國Cepheid公司。

1.3 檢查方法 所有患者行支氣管鏡檢查后收集肺泡灌洗液3份（5ml/份），分別行抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養與Xpert MTB/RIF檢測，若液體培養陽性則進一步行藥敏試驗。（1）抗酸染色涂片法：肺泡灌洗液標本離心濃縮，參照《結核病實驗室標準化操作與網絡建設》進行操作[5]。（2）分枝桿菌液體培養法：應用BACTEC MGIT 960全自動分枝桿菌培養鑒定藥敏系統進行分枝桿菌的快速培養與藥敏鑒定。（3）Xpert MTB/RIF檢測法：按照Xpert MTB/RIF設備說明書進行操作，將采集到的肺泡灌洗液標本抽取1ml與含有氫氧化鈉及異丙醇的處理液2ml混合，震蕩30s，室溫靜置15min，使生物危險度下降；再吸取2ml處理后的標本移至一次性多室反應盒中，將反應盒置入檢測模塊，約2h讀取結果。

1.4 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者Xpert MTB/RIF檢測結果比較 觀察組肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測陽性率為73.9%（116/157），明顯高于對照組的1.8%（1/56），兩組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 觀察組抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養及Xpert MTB/RIF檢測陽性率比較 觀察組中，肺泡灌洗液抗酸染色涂片、分枝桿菌液體培養及Xpert MTB/RIF檢測陽性率分別為 20.4%（32/157）、38.9%（61/157）和 73.9%（116/157），其中抗酸染色涂片陽性的32例患者分枝桿菌液體培養均為陽性，分枝桿菌液體培養陽性的61例患者Xpert MTB/RIF檢測均為陽性。以上3種方法陽性率經兩兩比較，XpertMTB/RIF檢測法＞分枝桿菌液體培養法＞抗酸染色涂片法，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。Xpert MTB/RIF檢測陽性而分枝桿菌液體培養陰性的55例患者中，Xpert MTB/RIF檢測結果均為低含量或極低含量。

2.3 Xpert MTB/RIF檢測診斷利福平耐藥的效能 觀察組中分枝桿菌液體培養陽性的61例患者經Xpert MTB/RIF檢測均為陽性，對這61例患者進行藥敏試驗，鑒定對利福平的耐藥性。以分枝桿菌液體培養藥敏試驗結果為金標準，液體培養藥敏鑒定利福平耐藥10例；而Xpert MTB/RIF檢測利福平耐藥11例，其中液體培養耐藥的10例患者均被檢出。Xpert MTB/RIF檢測診斷利福平耐藥的靈敏度為100.0%（10/10），特異度為98.0%（50/51），與分枝桿菌液體培養的一致性較好。

3 討論

目前確診結核病的方法主要為抗酸染色涂片和分枝桿菌液體培養。抗酸染色涂片法具有快速、簡單的特點，但無法區分非結核分枝桿菌，同時對標本的菌量要求高，一般標本中結核菌數量≥10 000個/ml可檢出陽性；分枝桿菌液體培養法能提高一定的陽性率，同時也可區分非結核分枝桿菌以及檢測結核菌的耐藥性，但是所需時間較長，可能延誤疾病的診治，增加疾病傳播的風險[6]。Xpert MTB/RIF檢測技術是由美國Cepheid公司開發的一個結核菌檢測平臺，它是一種半巢式的熒光定量PCR體外診斷技術，能自動提取rpoB基因進行擴增，再用分子探針覆蓋81bp核心區，確定對利福平的耐藥性，該設備將樣品制備和定量PCR整合在一個封閉試劑盒中自動完成，2h內能從患者標本中檢測是否含有結核桿菌以及對利福平的耐藥性[7]。多項研究表明，該技術對涂陽標本的靈敏度達98%～100%[8-9]。目前，該技術在結核病防治中應用已被WHO許可。

現階段我國涂陰肺結核約占所有肺結核的70%，這些患者咳嗽、咳痰多不明顯，很難留取合格的痰標本，目前尚缺乏有效的檢測手段。支氣管鏡檢查能直接觀察氣管、支氣管及更遠端，可以進行支氣管黏膜活檢；同時可對病灶所在的肺葉、肺段進行肺泡灌洗，留取灌洗液進行檢測，從而增加陽性率。本研究兩組患者均進行支氣管鏡檢查，留取肺泡灌洗液進行檢測。觀察組肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測陽性率（73.9%）明顯高于對照組（1.8%），提示Xpert MTB/RIF檢測在涂陰肺結核患者肺泡灌洗液中有較高的特異度，與牛波等[10]報道結果一致。觀察組157例患者肺泡灌洗液抗酸染色涂片、分枝桿菌液體及Xpert MTB/RIF檢測陽性率比較結果：Xpert MTB/RIF檢測法＞分枝桿菌液體培養法＞抗酸染色涂片法，提示肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測對涂陰肺結核患者的診斷意義優于分枝桿菌液體培養法、抗酸染色涂片法，與李妍等[11]研究結果一致。Xpert MTB/RIF檢測陽性而分枝桿菌液體培養陰性的55例患者中，Xpert MTB/RIF檢測結果均為低含量或極低含量，與Rachow等[12]研究結果一致，提示在含菌量低的標本中，Xpert MTB/RIF檢測靈敏度優于分枝桿菌液體培養法，更適用于臨床上涂陰肺結核的診斷。有研究表明，Xpert MTB/RIF檢測對結核桿菌有特異性，與非結核分枝桿菌無交叉反應[13]，提示臨床上遇到涂片陽性但Xpert MTB/RIF檢測陰性者，需考慮非結核分枝桿菌的可能。

以分枝桿菌液體培養藥敏試驗結果為金標準，Xpert MTB/RIF檢測診斷利福平耐藥的靈敏度為100.0%，特異度為98.0%，兩者一致性良好，與國外報道一致[14-15]。其中有1例患者Xpert MTB/RIF檢測出利福平耐藥，而藥敏試驗提示敏感，因條件限制，未進行rpoB基因測序，故最終未明確其耐藥性；后經常規一線標準化方案治療及跟蹤隨訪，患者病灶吸收，病情好轉，故考慮為Xpert MTB/RIF檢測假陽性。結合相關文獻，Xpert MTB/RIF檢測假陽性的原因可能有以下3個方面：（1）儀器設備中B探針循環閾值延遲，導致出現假陽性結果[16]；（2）沉默子的突變導致核苷酸位點的改變，但是不改變所編碼的蛋白質性質[17]；（3）標本中結核分枝桿菌數量少所致[18]。由于Xpert MTB/RIF檢測存在假陽性的可能，當臨床上發現Xpert MTB/RIF檢測耐藥時，WHO推薦在進行常規藥物治療的同時對Xpert MTB/RIF檢測結果進行驗證，包括常規藥敏試驗或rpoB基因測序等[19]。

綜上所述，Xpert MTB/RIF檢測是一種新的結核病基因診斷技術，具有快速高效、操作簡單、安全性高、能同時檢測利福平耐藥性等特點，肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測診斷涂陰肺結核的靈敏度和特異度均較高，建議在涂陰肺結核患者中開展肺泡灌洗液Xpert MTB/RIF檢測。

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