CAⅨ在腎細胞癌中的表達及臨床意義

陶澤宇 李龍 楊小淮

腎細胞癌(RCC)是臨床上最常見的泌尿系統惡性腫瘤之一。腎細胞癌的發病率僅次于膀胱癌，并逐年增加[1]。30%～50%的腎細胞癌缺乏早期臨床表現，20%～30%的腎細胞癌早期出現淋巴轉移、骨轉移以及遠處轉移，即便未出現早期轉移的患者經手術干預后也會復發轉移，所以早期診斷和及時治療非常重要[2]。目前臨床上腎細胞癌的診斷以影像學檢查、穿刺活檢等為主，缺乏精準無創的方法。CAⅨ作為一種新型碳酸酐酶異構體，在研究中發現與腎癌的發生發展密切相關，該結構在VHL（Von hippellindau）基因的下游，由缺氧誘導因子-1 (HIF-1)通路激活[3]。隨著分子生物學的發展，CAⅨ可作為RCC診斷和治療的新靶點。腎癌的主要病理類型為透明細胞腎細胞癌(ccRCC)，占60%～85%[4]。本研究利用免疫組化SP法檢測腎透明細胞癌中CAⅨ的表達情況并結合相關文獻分析，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取我院2015～2017年腎癌根治術后病理標本中腎透明細胞癌標本60例，其中男37例，女23例；年齡27～75歲，平均53歲；采用2010年AJCC的TNM分期和AJCC分期組合：其中Ⅰ期18例，Ⅱ期29例，Ⅲ期10例，Ⅳ期3例；以20例其他少見類型腎癌標本和30例正常腎組織標本作為對照。其中，8例腎乳頭狀癌，7例腎嫌色細胞癌，3例Bellini集合管癌，2例囊性腎細胞癌，正常腎組織標本均取自單純性腎切除術后。標本均在35%甲醛溶液固定后包埋于蠟塊中。實驗材料包括：CAⅨ單抗、二甲苯、PBS緩沖劑、DAB顯色劑、枸櫞酸緩沖液等。

1.2 方法 ①烤片:于70℃烤片機中烤20min。②二甲苯脫蠟后梯度乙醇脫水:組織切片浸泡于二甲苯中20min→更換50%二甲苯浸泡5min→100%酒精5min→80%酒精5min→70%酒精5min。蒸餾水:洗脫5min，2次。③阻滅內源性過氧化物酶:3%過氧化氫37℃孵育10min，PBS清洗15min。④抗原修復:0.01 M檸檬酸緩沖液(pH 6.0)，煮沸(95℃，15～20min)，冷卻 25min，冷水冷卻至室溫后清洗，再用PBS洗滌10min。⑤染色觀察:置于4℃恒溫箱加入CAⅨ單克隆抗體孵育過夜，DAB染色劑染色。成功染色后，用蒸餾水沖洗，并在顯微鏡下觀察蓋玻片。

1.3 統計學分析 采用SPSS 16.0統計軟件進行單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

60例ccRCC標本中CAⅨ的陽性表達率為85.0%(51/60),正常腎組織中CAⅨ陽性表達率為0。CAⅨ在腎乳頭狀癌中陽性表達率為25.0%(2/8)，在嫌色細胞癌中陽性表達率為14.3%(1/7)，在Bellini集合管癌和囊性腎細胞癌中無陽性表達。CAⅨ在腎透明細胞癌中表達水平明顯高于正常腎組織和其他少見類型腎癌，差異有統計學意義（χ2=99.2，P＜0.05）。

3 討論

腎細胞癌約占成人惡性腫瘤的2%～3%，是第二常見的泌尿系統惡性腫瘤，發病率僅次于膀胱癌，呈逐年上升趨勢[4]。因缺乏特征性臨床表現，早期僅6%～10%患者會出現典型的血尿、腰痛、腹部腫塊等，大部分為無癥狀腎癌，約占63%[5]，所以腎癌的早期診斷和治療非常重要。目前，早期腎癌的診斷主要依靠影像學方法和臨床醫師的經驗，具有偶然性和不確定性，尚無特異性腫瘤篩查方法。此外，對于晚期腎癌仍無有效的治療方法。

CAⅨ在正常組織中表達水平極低，僅在成人輸精管上皮、膽管、脈絡膜血管叢、小腸和腮腺等組織中散在表達，而在胎兒成熟的肺和肌肉組織中具有較高的表達[6]。但在腎癌中CAⅨ的表達與其他組織表達機制不同，可能與缺氧誘導因子(HIF)和其它轉錄因子被充分羥基化有關。CAⅨ是VHL-HIF信號通路的下游基因，VHL是一種腫瘤抑制基因，VHL蛋白具有降解HIF的作用，能夠維持正常細胞的有氧微環境。當VHL突變或丟失，HIF在細胞內累積，在腫瘤細胞周圍形成缺氧的微環境并激活其下游靶基因CAⅨ[7]。CAⅨ是一種由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，它可以將細胞內的H+通過H+-Na+離子泵輸送到細胞外[8]。兩者共同造成適合腫瘤生長的酸性缺氧微環境。

腎癌尚缺乏早期診斷手段，而CAⅨ在腎癌中的特殊高表達性可作為潛在腫瘤標志物的依據，因CAⅨ主要存在于腎癌腫瘤細胞，在外周血幾乎檢測不到CAⅨ，所以有學者提出檢測腎癌患者外周血中的CAⅨ-mRNA來間接判斷原發腫瘤中CAⅨ的水平。Mckieman等[9]應用RT-PCR技術研究腎細胞癌患者的外周血CAⅨ-mRNA表達，結果發現在46%未轉移以及56%已轉移腎細胞癌患者的外周血中出現陽性表達，而腎良性病變患者不表達。通過統計學分析發現CAⅨ-mRNA具有97.6%的特異性和48.7%的敏感性。國內學者向萌[10]利用RT-PCR技術，檢測30例腎細胞癌患者及30例腎良性病變患者外周血中CAⅨ-mRNA水平，結果顯示，腎細胞癌患者外周血中CAⅨ-mRNA陽性表達率為43%(13/30)，而腎良性病變患者外周血中均呈陰性，且腎透明細胞癌患者外周血中CAⅨ-mRNA的陽性表達率54.5%(12/22)明顯高于其他組織類型(P＜0.05)。說明CAⅨ作為腎癌腫瘤標志物時具有高度特異性，但敏感性較差，無論有無早期轉移，均能在外周血中檢測到CAⅨ-mRNA，且在腎透明細胞癌中更加敏感。

對于腎癌的非手術治療，目前主要利用CAⅨ的免疫源性在體外構建其單克隆抗體復合體，目前主流的嵌合型mAb-CAⅨ(WX-CAIX)在腎癌組織中有很高的濃聚性，可用于診斷及治療。Siebels等[11]實驗中將WX-CAⅨ與低劑量干擾素-α（LD-IFNα）聯合用于治療進展期轉移性腎細胞癌（mRCC），26例根治性腎切除術后患者被納入試驗，結果顯示42%（11/26）患者療效顯著。接受延長治療的患者比16周停藥患者的2年生存率更長（79% vs 30%，P=0.0083）。Bleumer等[12]進行了相同的實驗，共納入36例mRCC患者，均未出現藥物相關的Ⅲ或Ⅳ級毒性反應，只有3例患者出現了可能與研究藥物相關的Ⅱ級毒性反應。上述兩者實驗結果證實該治療安全可靠，耐受性良好，且藥物毒性小。

本實驗中腎癌CAⅨ的測定主要取自術后病理，反映的主要是腫瘤局部CAⅨ的表達水平，對診斷和治療的指導意義尚存在局限性，但對腎癌患者的預后判斷具有重要價值。Bui等[13]對腎癌病理組織中CAⅨ進行染色率測定，以85%為界限，結果顯示高染色率患者的總體生存中位數為24.8個月，而低染色率為5.5個月，結果表明低表達CAⅨ是預后差的標志。而本實驗中60例腎透明細胞癌的CAⅨ在TNM分期Ⅰ、Ⅱ期的陽性表達率明顯高于Ⅲ、Ⅳ期（97.9%vs 38.5%，P＜0.05），與上述實驗結論吻合。傳統分期對預后判斷有局限性，加利福尼亞大學在其開發的UISS腎癌風險分級系統基礎上進行改良，將CAⅨ加入評價系統，將腎癌患者分為低、中、高3個風險組，利用基因芯片技術對腎癌組織進行多分子檢測，結果發現CAⅨ高表達是預后良好的標志[14]，這種定量測定技術使腎癌預后判斷效率和準確性大大提高。本實驗中腎透明細胞癌組中CAⅨ的陽性表達率為85.0%(51/60)，明顯高于其他組，而臨床上最常見的腎癌類型即腎透明細胞癌，所以該方法對大部分腎癌患者預后判斷具有重要的指導意義。

綜上所述，CAⅨ在腎細胞癌尤其是腎透明細胞癌中高度表達，在正常的腎組織中無表達，這種表達特異性使得CAⅨ在腎癌診斷、治療及預后評估方面具有很高的研究價值，特別是作為腫瘤標志物和靶向治療藥物，尚需要更多的臨床試驗來驗證CAⅨ的臨床價值。