基于線粒體DNA D-loop序列的五華三黃雞遺傳多樣性及其品種起源研究

黃勛和，余哲琪，翁茁先，3，溫金星，李威娜，鐘 鳴，唐亞東，鐘福生

（1.嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015；2.廣東省五華三黃雞科技創新中心，廣東 梅州 514015；3.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；4.五華縣田家炳中學，廣東 梅州 514400；5.廣東客家黃畜牧有限公司，廣東 興寧 514571）

家雞是迄今分布最為廣泛的馴養動物之一，為人們提供了穩定的蛋白質來源，同時在娛樂（斗雞）、裝飾（羽毛）、宗教（祭祀）等人類活動中起著重要作用［1］。地方家禽遺傳資源是生物多樣性的重要組成部分，是長期進化過程中遺留下來的寶貴財產［2-3］。五華三黃雞是優良的地方雞種，主要分布在廣東省梅州市五華縣［4-5］。五華三黃雞具有悠久的飼養歷史，因其肉質肥嫩鮮美、高蛋白、低脂肪而深受當地人們的喜愛。由于資源保護意識相對薄弱、外地優勢雞種和商品雞的沖擊以及人們消費觀念的轉變，該品種的種群數量正不斷減少，遺傳資源保護形勢嚴峻［5］。為科學保護和合理利用五華三黃雞品種資源，嘉應學院對五華三黃雞品種資源、品種特性、保種選育、健康養殖、品種起源等方面進行了系統研究，取得了較大的進展［5-15］。

動物線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）因結構簡單、含量豐富、突變速率快、母系遺傳等特點，自20世紀90年代開始，被廣泛應用于追溯家雞的馴化歷史［16］。黃勛和等［17］采用PCR產物直接測序法對五華三黃雞豐華和太和兩個群體的mtDNA 控制區全序進行了分析并構建系統進化樹，結果表明五華三黃雞與中國紅原雞親緣關系最近。隨后測定了mtDNA基因組全序列并進行了系統進化分析，結果也支持控制區全序的分析結論［15，18］。運用微衛星標記研究表明五華三黃雞保留著較高的遺傳多樣性水平［12-14］，但基于mtDNA D-loop的群體遺傳學研究則尚未開展。本研究應用mtDNA D-loop序列對五華三黃雞進行遺傳多樣性分析，評估保種選育效果，檢測種群遺傳動態，同時探討品種的歷史淵源，為五華三黃雞的科學保護和合理開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的120份血液樣品采自五華三黃雞保種場，采集時間為2016年9月。隨機選取保種群體個體于肱靜脈取血，置于終濃度70%乙醇中-80℃保存。采用血液DNA小量提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）提取基因組DNA，-20℃保存備用。同時在GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）下載中國其他地區和東南亞、南亞家雞以及紅原雞的D-loop序列。

1.2 PCR擴增與序列測定

PCR擴增mtDNA D-loop引物：L16750，5'–AGGACTACGGCTTGAAAAGC–3'［19］；H522，5'–ATGTGCCTGACCGAGGAACCAG–3'［20］。反應體系為30 μL，包括10×擴增緩沖液（含Mg2+）3 μL，4種dNTP混合物（2.5 mmol/L）2.4 μL，正反向引物（20 μmol/L）各0.3 μL，模板DNA 1 μL，rTaqDNA聚合酶（5 U/ μL）0.3 μL，滅菌ddH2O 22.7 μL。反應條件為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s、63℃復性1 min、72℃延伸50 s，35個循環；最后72℃延伸7 min。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳確認后，送往廣州艾基生物技術有限公司使用擴增引物進行雙向測序。

1.3 序列分析

用Bioedit［21］軟件對測序序列進行人工校對，用ClustalX 1.81［22］軟件進行序列比對，然后以紅原雞mtDNA D-loop序列（GenBank登錄號：NC_007235）作為參考序列，使用DnaSP 5.1［23］軟件定義單倍型，提取變異位點（Variable sites，V），計算核苷酸多樣性（Nucleotide diversity，π）、核苷酸差異均數（Average number of nucleotide differences，K）、單倍型多樣性（Haplotype diversity，Hd）以及中性檢驗。用MEGA 6.0［24］軟件分析其堿基組成，Kimura 2-parameter（K2P）模型計算群體間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建五華三黃雞單倍型與其他家雞及紅原雞單倍型的無根鄰接樹。單倍型類群的命名參照文獻［25-26］。

2 結果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

除去引物序列，共獲得520 bp mtDNA D-loop序列，其中堿基T、C、A、G的平均含量分別為30.1%、29.9%、27.4%、12.6%，T+A的平均含量為57.5%，C+G的平均含量為42.5%。 120份樣品共檢測到33個突變位點，占總分析位點的6.35%；其中簡約信息位點19個，單一位點突變14個。突變類型均為轉換，包括23個T＞C轉換和10個A＞G轉換。以NC_007235作為參考序列，在33個突變位點中定義了32種單倍型，包括獨享型單倍型19個，共享型單倍型13個，其中B01為優勢單倍型，B20居第2位（表1）。總體單倍型多樣性為0.913 ± 0.012，核苷酸多樣性為0.01298 ± 0.00051，核苷酸差異均數為6.750，單倍型遺傳距離為0.013 ± 0.003（表2）。其中單倍型類群B的遺傳多樣性最高，E次之，C最低。中性檢測顯示Fu’sFs值差異顯著，而Tajima’s D值差異不顯著；但獨立檢測發現除單倍型類群A外，其他單倍型類群的D檢驗均顯示差異顯著。

表1 五華三黃雞mtDNA D-loop單倍型及其在不同地區的共享單倍型數量

（續表1）

表2 五華三黃雞單倍型類群遺傳多樣性統計

2.2 系統進化分析

以家雞和紅原雞的390種代表單倍型與五華三黃雞的32種單倍型構建無根鄰接樹。無根鄰接樹分化為13枝（A、B、C、D、E、F、G、H、I、W、X、Y和Z），五華三黃雞單倍群主要分布在A、B、C和E 4枝中（圖1），對應的頻率分別為5%（6/120）、52.5%（63/120）、16.67%（20/120）和25.83%（31/120），B為優勢單倍型類群。此外，統計了2 299只中國家雞的單倍型，其中與五華三黃雞單倍型類群A共享的單倍型有341個，與B共享的有495個，與C共享的有117個，與E共享的有216個。將廣東省及周邊地區劃分為華東、華北、華中、華南、西南5個區域，從表1可見，與五華三黃雞共享單倍型最多的是西南地區、約占38.12%，華東地區次之（28.38%），第三是華中地區（19.32%），第四是華南地區（9.15%），最后是華北地區（1.62%）。

2.3 進化支的地理分布

在3700只家雞和紅原雞中，A、B、C和E進化枝在大部分地區都有分布，其中B為優勢單倍型類群，約占總數的29.19%，A次之，占總數的22.27%；進化枝D、F、G只分布在部分地區，進化枝H、I、W、X、Y和Z僅在少部分地區特有（表3）。由此可見，家雞和紅原雞呈現出地理分布特征，部分地區還具有相似的單倍型類群組成。相比之下，江西省、云南省、東南亞、南亞家雞，東南亞紅原雞擁有更豐富的遺傳變異。

圖1 390種家雞和紅原雞單倍型與32種五華三黃雞單倍型構建的無根鄰接樹

表3 家雞和紅原雞主要進化枝的地理分布

3 結論與討論

本研究應用mtDNA D-loop序列研究了五華三黃雞的遺傳多樣性，并探討其遺傳起源。五華三黃雞mtDNA D-loop的C+G含量低于T+A含量，符合鳥類線粒體控制區的堿基含量組成，與其他禽類的研究報道相一致［27-30］。衡量群體線粒體DNA的突變程度取決于單倍型遺傳距離、單倍型多樣性、核苷酸多樣性和核苷酸差異均數，當遺傳距離大于0.01時則被認為有較大的變異水平［31］。五華三黃雞的遺傳距離為0.01 ±0.003，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.913±0.012和0.01298±0.00051，高于國內許多地方雞品種，如廣西6種地方雞［32］、溧陽雞［33］、麒麟雞［34］。這與微衛星標記研究結論相一致［12-14］，說明目前五華三黃雞群體遺傳多樣性較高，有利于后續的保種選育工作的開展。

家養動物伴隨著人類的遷移而擴散至世界各地［1］。五華三黃雞主要分布于廣東省梅州市，與福建省龍巖市和江西省贛州市接壤，是粵閩贛客家地區中心之一。客家民系是從中原地區經過多次南遷，融合本地民眾而成［35］。在遷移過程中，家養動物不可避免地伴隨人類擴散至客家地區。五華三黃雞獨享單倍型數約占其總數的60%，說明該品種具有較為久遠的飼養歷史，并且與外界交流較少，仍保留著其獨特的遺傳特性，如尾羽和翅下為白色。中性檢驗發現五華三黃雞部分單倍型類群經歷了群體歷史擴張，但未發現品種特有的進化枝。五華三黃雞的單倍型組成與廣東省其他地方雞相似，也與江蘇省、江西省、浙江省、東南亞家雞接近，表明五華三黃雞在品種形成過程中受到了人類社會活動和商品貿易的影響，品種間的遺傳差異正逐步縮小。

家雞的馴化起源自達爾文時代起就備受關注和爭議［16］。mtDNA研究認為，南亞、東南亞、中國西南都可能是家雞的起源地之一，并且經歷了多次獨立的馴化［25，36-39］。鄰接樹顯示五華三黃雞可劃分為A、B、C和E 共4個單倍型類群，鑒于mtDNA具有嚴格遵循母系遺傳的特性，可認為五華三黃雞具有4個母系來源。五華三黃雞品種形成受到了南遷家雞的影響，但是否遺傳起源于北方，則存在較大的爭論［40-42］。將來需結合考古學、基因組學等證據深入探討家雞的遺傳起源和擴散歷史。

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