細胞免疫熒光法在視神經脊髓炎患者血清及腦脊液中水通道蛋白-4抗體檢測中的運用價值

趙鶴進

視神經脊髓炎因其嚴重的臨床癥狀，極大影響了人們生活質量和生命安全，及早采取鑒別診斷就顯得格外重要。隨著水通道蛋白-4(anti-aquapprins-4，AQP-4)在脊髓和視神經細胞上的慢慢發現[1]，以及水通道蛋白-4抗體(APQ-4Ab)在視神經脊髓炎發病中的作用機制的認識，尤其是可以與臨床癥狀極為相似多發性硬化進行鑒別[2]，采用合理有效的APQ-4Ab檢查方法是本研究關注的重點。我們將細胞免疫熒光法(CBA)、乳膠免疫增強比濁法(PETIA)和酶聯免疫法(ELISA)3種檢查方法在血清和腦脊液中進行檢測分析比較，為臨床診斷提供實驗依據，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在2013年6月至2017年4月在我院診斷為視神經脊髓炎患者58例(NMO組)和49例多發性硬化患者(MS組)。視神經脊髓炎的診斷標準主要包括視敏度的下降、視網膜厚度減少、視覺誘發電位異常、MRI提示超過3個脊柱節段受損等[3]。多發性硬化診斷參照張星虎等人提出的診斷標準[4]。排除標準包括嚴重心腦血管疾病患者、合并有其他器質性神經系統疾病患者已有經過免疫抑制劑和激素治療的患者。同時選取體檢健康人群45例作為對照組。本研究經過醫院倫理委員會同意，所有患者均知情同意。

1.2 樣本采集 3組患者均空腹促凝管采血3 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血清－20℃保存以備研究。NMO組和MS組患者需行腰椎穿刺留取腦脊液標本0.5 mL，3 000 r/min離心5 min，分離上清液－20℃保存以備研究。

1.3 檢測方法 主要是檢測(APQ-4Ab)。①CBA檢測采用上海銳塞生物試劑盒，按照其說明書提供的檢測步驟，將血清和腦脊液與標準細胞孵育后采用熒光顯微鏡觀察，細胞膜出現綠色熒光為陽性結果。②PETIA檢測采用上海銳塞生物試劑盒，按照說明書提供的檢查步驟操作，測定散射光的變化率。以說明書提供的參考值判斷陽性結果。③ELISA檢測采用上海銳塞生物試劑盒，按照說明書提供的檢查步驟操作，450 nm處讀取吸光值，以說明書提供的參考值判斷陽性結果。

1.4 觀察指標 ①3組人群和3種檢測方法APQ-4Ab陽性率的比較。②敏感性和特異性的比較，敏感性＝檢測陽性人數/(真陽性人數＋假陰性人數)×100%。特異性=檢測陰性人數/(真陰性人數＋假陽性人數)×100%。

1.5 統計學方法 應用SPSS 22.0統計學軟件進行數據的分析和處理。計量資料采用(±s)表示，計數資料采用[n(%)]表示。計量資料采用t檢驗，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組患者一般資料比較(表1) 經卡方檢驗，各組在性別和病程上差異無統計學意義(P＜0.05)，方差分析顯示，3組在年齡上差異無統計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

表1 3組患者一般資料比較[n，(±s)]

表1 3組患者一般資料比較[n，(±s)]

組別 例數 性別(男/女) 年齡/歲 病程/月NMO組 58 28/30 43.7±5.9 12.3±2.6 MS組 49 24/25 44.6±5.7 11.8±3.3對照組 45 23/22 43.2±6.1 χ2/F值 1.65 2.61 0.89 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2.2 3種檢測方法在不同分組血清APQ-4Ab陽性率的比較(表2) 雖然3種檢測方法在NMO組、MS組和對照組中APQ-4Ab的檢測陽性率均有差異(χ2＝11.64，8.52，7.49，P＜0.05)，但是在NMO組中，CBA法檢測APQ-4Ab的陽性率為81.1%，高于PETIA法的55.2%和ELISA的43.1%(χ2＝6.23，P＜0.05)。在MS組中，3種檢測方法差異無統計學意義(χ2＝1.17，P＞0.05)。3種檢測方法在對照組中APQ-4Ab陽性率均為0。

表2 3種檢測方法在不同分組血清APQ-4Ab陽性率的比較

2.3 3種檢測方法在不同分組腦脊液APQ-4Ab陽性率的比較(表3) 同樣3種檢測方法在NMO組、MS組腦脊液中APQ-4Ab陽性率均有差別(χ2＝7.92，8.24，8.15，P＜0.05)，但是在NMO組中，CBA法檢測APQ4-Ab的陽性率為84.5%，高于PETIA法的58.6%和ELISA的48.3%(χ2＝10.52，P＜0.05)，在MS組中，3種檢測方法差異無統計學意義(χ2＝0.84，P＞0.05)。

表3 3種檢測方法在不同分組腦脊液APQ-4Ab陽性率的比較[n(%)]

2.4 3種檢測方法在NMO組血清和腦脊液檢測APQ-4Ab的敏感性和特異性比較(表4) 本研究計算的是NMO組血清和腦脊液總敏感性和特異性，結果可見，CBA的敏感性為83.1%，高于PETIA的62.4%和ELISA的57.6%(χ2＝6.85，P＜0.05)。3種檢測方法的特異性都可達到90%以上，但差異無統計學意義(χ2＝0.78，P＞0.05)。

表4 3種檢測方法在NMO組血清和腦脊液檢測APQ-4Ab的敏感性和特異性比較 單位：%

3 討論

視神經脊髓炎又稱Devic綜合征，是視神經和脊髓同時或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變，好發于青狀年，兒童也有常見，男女均可發病。臨床多表現為不同程度的視力敏感度下降、甚至失明，感覺喪失，下肢癱瘓等。短時間的視力障礙和癱瘓是本病的特點[5]。發病機制不詳，可能原因是與病毒感染導致機體自身免疫系統功能混亂，造成視神經和脊髓脫髓鞘病變。臨床診斷檢測方法主要包括眼部和脊髓神經檢測、血清和腦脊液分析和影像學檢查，是多系統聯合檢查完成對其診斷。在以往的研究中，由于臨床癥狀的相似性，視神經脊髓炎被誤認為是多發性硬化的一種亞型[6]，但隨著醫學的發展，慢慢發現視神經脊髓炎在影像學、血清學檢查等與多發性硬化都有很大的不同。MRI檢查上，視神經脊髓炎受損的脊髓節段往往在3個或3個以上，稱之橫貫性脊髓炎，而多發性硬化的病灶多在大腦半球上，脊髓很少受損超過3個。血清學檢查上，APQ-4Ab是能夠早期區別視神經脊髓炎和多發性硬化的檢測指標，并對視神經脊髓炎指導用藥、預后、復發等均有重大價值[7]。APQ-4是分布在中樞神經系統的水通道跨膜轉運蛋白上，在大腦、脊髓和視神經均有可見。不同部位的APQ-4發揮不同功能，共同參與腦脊液分泌和重吸收，以及維持大腦神經細胞內外離子平衡[8]。APQ-4Ab又稱視神經脊髓炎特異性抗體(NMO-lgG)。病理狀態下，APQ-4Ab能激活補體系統，導致視神經和脊髓脫髓鞘炎性病變，可破壞血腦屏障、誘導星型膠質細胞死亡、中樞系統神經元丟失等[9]。同時也支持視神經脊髓炎是一種主要由體液免疫介導的自身免疫性疾病。

CBA是將熒光素標志在已知的細胞抗原或抗體上，在與相應抗體進行特異性結合，在細胞上形成含有熒光素的抗原抗體復合物，通過顯微鏡可以直接觀察熒光反應來判斷結果。這種檢測方法具有檢測速度快、準確性高、敏感性和特異性強的優點。而常規的抗原抗體結合檢測方法如PETIA和ELISA存著一些問題，如前帶后帶現象、脂血溶血、比色杯和光源對檢測的影響，導致準確性和敏感度上有一定缺陷[10]。本研究主要進行比較了CBA、PETIA和ELISA這3種檢查方法對于APQ-4Ab檢測能力的比較。從確診的NMO患者、MS患者以及健康人群的分組中可以看到，這3種方法在3組人群的血清和腦脊液中APQ-4Ab檢測均有差異性，提示這3中檢查方法都可以在一定程度上用于視神經脊髓炎的鑒別和診斷。但是在確診的NMO組中，無論是腦脊液還是血清中，CBA對于APQ-4Ab檢測的陽性率均高于PETIA和ELISA，可以說明CBA對于APQ-4Ab的檢測準確性還是高于常規的抗原抗體檢測方法。在檢測敏感性上，CBA法的敏感性為83.1%，高于PETIA和ELLISA法。而在特異性上，3種檢測方法幾乎差距不大，都在90%以上，進一步證明細胞免疫熒光法對于水通道蛋白-4抗體檢測的重要性。

綜上所述，CBA在視神經脊髓炎患者血清及腦脊液中APQ-4Ab檢測中具有較高的準確性，且敏感性和特異性俱佳，值得在臨床上大力推廣。

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