慢生長黏液型銅綠假單胞菌的鑒定分析

徐新艷 趙水娣

銅綠假單胞菌是臨床感染常見病原菌之一，也是支氣管擴張、慢性阻塞性肺氣腫、肺囊性纖維化等病變繼發感染的主要病原菌[1]。隨著抗生素的過度使用，導致臨床標本中分離出的細菌菌落形態發生變異，給鑒定工作帶來困難。現和大家共同探討我院1例慢性阻塞性肺氣腫患者的痰標本中分離的慢生長黏液型銅綠假單胞菌的檢測。

1　材料與方法

1.1一般資料 患者，男，63歲，于多年前就無明顯誘因出現咳嗽，咳少量白色泡沫樣痰，并伴有胸悶氣喘，呼吸困難，每年持續3個月以上。多次于我院就診，診斷為：慢性阻塞性肺氣腫、支氣管擴張癥。2017年1月因慢性阻塞性肺氣腫急性發作入院。患者入院時體溫、血壓、心電圖均正常。有“頭孢菌素、青霉素、氨基酸”藥物過敏史，無高血壓病、糖尿病、心臟病等慢性病史。

1.2方法

1.2.1儀器 VITEK2-compact全自動微生物分析儀、VITEK MS快速細菌鑒定系統，法國生物梅里埃公司。DL-DYE-GR-16染色儀，珠海迪爾生物工程有限公司。

1.2.2試劑 GN卡、GN13卡，法國生物梅里埃公司。革蘭氏染色液為珠海迪爾生物工程有限公司產品。藥敏紙片、氧化酶紙片、噢普托欣紙片均為英國OXOID公司產品。血平板與巧克力平板為上海科瑪嘉微生物技術有限公司產品。10%氫氧化鉀、觸酶試劑均為自配。藥敏判斷參照2017CLSI。

1.2.3質控菌株 質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎鏈球菌ATCC49619和糞腸球菌ATCC29212，均購自江蘇英科新創醫學科技有限公司。

1.3細菌培養與鑒定 根據標本采集要求留取痰標本，及時接種血平板和巧克力平板，同時涂片。痰直接涂片鏡檢結果是白細胞>25/LP，上皮細胞<10/LP，為合格痰，革蘭染色主要見G-桿菌；痰培養24h結果血平板生長溶血小菌落，近似草綠色鏈球菌，巧克力平板未生長。48h血平板的小菌落長成大黏、不規則的水滴狀，疑似黏液型肺鏈球菌，72h開始菌落又縮小，類似于自溶，巧克力平板仍然未生長。涂片革蘭氏染色為G-桿菌；純化分別轉種血平板和巧克力平板，24h血平板見生長透明小菌落，巧克力平板未生長。再次涂片革蘭氏染色為G-桿菌；考慮該菌生長緩慢，為了排除陽性菌，做了下列鑒定試驗，結果分別為萬古霉素藥敏（R）、10%氫氧化鉀拉絲試驗（+），噢普托欣試驗（-），氧化酶（+），觸酶（+），而 VITEK2-compact（0.5麥氏單位）和質譜儀鑒定，均未出結果，KB法（0.5麥氏單位）藥敏不生長；復傳三代，第四和第五次傳代的血平板上菌落生長狀態漸好，巧克力平板從第四代開始緩慢生長。用第五次傳代的菌在VITEK2-compact（0.5麥氏單位）進行生化鑒定，鑒定編碼為0002041303500000銅綠假單胞菌，98%符合率。藥敏儀器未檢出結果，用KB法（0.5麥氏單位）測出對阿米卡星、頭孢吡肟、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、替卡西林、替卡西林/克拉維酸、氨曲南、美羅培南、頭孢哌酮/舒巴坦、慶大霉素均敏感，左氧氟沙星、亞胺培南均耐藥。

2　討論

銅綠假單胞菌在血平板可形成五種菌落：典型菌落、大腸菌樣型菌落、黏液性菌落、侏儒型菌落和粗糙型菌落[2]。菌落異常使同一菌株被誤認為是不同的細菌，給細菌的鑒定帶來困難。黏液型細菌的胞外多糖具有干擾正常宿主吞噬防御和促進生物膜形成的能力，與肺功能下降和預后差有關[3]，影響治療效果。黏液性菌落變異型在囊性纖維化患者的呼吸道標本中很常見，與間歇性定植相關，黏液型細菌的出現也是慢性感染的一個標志[4]。

目前，針對不典型銅綠假單胞菌，尤其生長緩慢的黏液型銅綠假單胞菌，無較好的檢測方法和手段，一是細菌生化鑒定儀：比較通用的有增加菌液濃度，但是并無可靠的文獻支持；二是質譜：去除菌落表面的黏液，取基底部的細菌做質譜檢測。這兩種方法雖能鑒定出細菌，但藥敏試驗常因為不生長而無結果。有文獻報道[5]，黏液型銅綠假單胞菌和非黏液型銅綠假單胞菌之間可以相互轉變。將黏液型銅綠假單胞菌經傳代的方式進行反祖，結果發現，經過反復傳代后，較容易恢復為非黏液型銅綠假單胞菌利于鑒定和藥敏試驗。本案例慢生長黏液型銅綠假單胞菌最初用上述兩種方法檢測均未出結果，經過5次傳代生長良好后用細菌生化鑒定儀鑒定出結果，藥敏仍然未出結果，最終用KB（0.5麥氏單位）法測出藥敏結果。最佳的傳代次數還在試驗中，有待繼續探討。

綜上所述，我們認為在遇到細菌菌落不典型的情況下要參考痰涂片的結果，痰涂片革蘭氏染色鏡檢能客觀地反映細菌感染的真實情況，給痰培養提供一定的指導作用[6]，依據痰涂片結果在平板尋找相應的目標菌及時分離培養，針對該目標菌找出最合適的鑒定方法，及時檢測出藥敏試驗結果，才能更好地服務于臨床。

1趙德軍，付維嬋，胡照宇，等.慢性阻塞性肺疾病患者下呼吸道感染銅綠假單胞菌耐藥性分析[J].中華醫院感染學雜志，2011，21（11）：2340-2341

2張秀珍，朱德妹.臨床微生物檢驗問與答[M].北京：人民衛生出版社，2014：146

3 Farrell PM，Collins J，Broderick LS，et al.Association between mucoid Pseudomonas infection and bronchiectasis in children with cystic fibrosis[J].Radiology，2009，252（2）：534-543

4詹姆斯H.約根生，邁克爾A.普法勒，主編，王輝.等譯.臨床微生物學手冊[M].11版.北京：中華醫學電子音像出版社，2017：984-988

5李瑜珍，曾學輝，李忠新，等.痰粘液型銅綠假單胞菌的分離及耐藥性分析 [J].中華醫院感染學雜志，2014，24（5）：1059-1060

6尚紅，王毓三，申子瑜.全國臨床檢驗操作規程[M].北京：人民衛生出版社，2014：636-638