玉米萌發期耐冷性鑒定方法研究進展

曹士亮 于 滔 扈光輝 王成波 曹靖生

（黑龍江省農業科學院玉米研究所/農業部東北北部玉米生物學與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150086）

玉米種子順利萌發出苗是獲得玉米高產的第一步，對玉米生產具有重要的意義。萌發期冷害是制約世界高緯度冷涼地區玉米生產的重要因素之一，其導致玉米萌發、出苗緩慢，增加病菌入侵機率，加重病害發生，造成種子霉變、腐爛，給玉米生產帶來嚴重的損失，是導致我國東北地區玉米產量不穩、品質不高的主要原因[1]。生產上主要采用標準發芽試驗對玉米種子的發芽率進行標定。但玉米標準發芽率是在適宜溫度下玉米出苗能力的體現，難以有效反映玉米在低溫不利條件下的出苗能力。隨著玉米單粒播種技術的推廣，生產上對玉米種子的質量要求越來越高，選育萌發期耐冷性強的玉米品種已經成為高緯度地區玉米育種的重要目標。準確可靠的玉米萌發期耐冷性鑒定方法是有效評價玉米萌發期耐冷性、開展玉米萌發期耐冷性遺傳和育種研究的基礎和關鍵。長期以來，不同學者和實驗室根據各自的試驗目的對影響玉米低溫萌發的因素進行了大量研究，形成了一系列玉米萌發期耐冷性鑒定的方法[2]。本文就當前玉米萌發期耐冷性鑒定的研究方法、評價指標和影響因素進行分析和綜述，以期為開展相關研究提供一定的參考。

1 對玉米萌發期和發芽率概念的理解

玉米種子的萌發被定義為種子的胚從相對靜止狀態變為生理活躍狀態，并長成幼苗的過程，這一過程一般可分為4個階段，即吸脹階段、萌動階段、發芽階段和成苗階段。我國農作物種子檢驗規程（GB/T 3543.4-1995）將發芽定義為在實驗室內幼苗出現和生長達到一定階段、幼苗的主要構造表明在田間的適宜條件下能否進一步生長成為正常的植株，即從種子到幼苗的過程；對發芽率的定義為在規定的條件和時間內長成的正常幼苗數占供檢種子數的百分率。一些學者在研究玉米耐冷性時根據胚根突破種皮的長短來定義發芽，發芽率則定義為胚根達到一定長度的種子占供試種子的比率[2]。此外，一些學者利用胚芽鞘伸長達到一定長度作為判斷發芽的標準。如此看來，由于對玉米萌發概念理解的不同會導致對玉米發芽率的定義存在差異。筆者認為玉米的萌發期可以從狹義和廣義兩個范圍來理解，狹義的萌發期應該指玉米從播種到出芽（Germination）這段時期，這里的出芽可以依據胚根突破種皮的長度來判斷，也可以依據胚芽鞘突破種皮的長度來判斷，通常這段時期也被稱為芽期（Germination Stage）；廣義的萌發期則是指從播種到出苗這段時期（Emergence Stage）。所以發芽率的概念至少應包括3層含義，一是萌動種子的比率（以胚根長度為依據）；二是發芽種子比率（以胚芽長度為依據）；三是出苗比率（以幼苗為依據）。這些指標都是對玉米低溫條件下生長發育活力的評價，可以根據具體的試驗目的和試驗條件來進行選擇。

2 玉米萌發期耐冷性鑒定方法分類

2.1 田間鑒定和室內鑒定 玉米萌發期耐冷性的田間鑒定通常利用自然環境，通過調整播期創造低溫條件。在開展田間鑒定時需要掌握試驗點溫度和降水等氣象資料，合理調整和選擇播種時期，使玉米萌發能夠處于低溫條件下。在選擇不同的播種時期后，記錄出苗的時期也要相應的發生變化。B.E.Clark[3]在對甜玉米的耐冷性進行田間鑒定時，5月播種3周后記錄出苗率，6月播種2周后記錄出苗率。盡管田間鑒定法比較接近生產實際，能夠客觀直接地對玉米耐冷性進行評價，但田間試驗的條件如低溫持續時間、降水量等條件不確定性較大，土壤、病原菌等情況也不盡相同，因此，田間耐冷性鑒定結果重復性差，且對于大部分高緯度地區來說，1年只能進行1次，特別是當試驗的材料較多時，需要占用大量的試驗用地，這些因素都限制了該方法的應用。

室內鑒定法可以通過模擬對玉米萌發不利的低溫條件，來預測玉米在田間低溫條件下萌發的表現[4]。最初，由于缺少室內耐冷性鑒定試驗與田間試驗的關系的研究，玉米萌發期耐冷性鑒定的結果難以得到很好的解釋[3]。后續的大量研究表明，通過調整室內鑒定的溫度、萌發基質、水分條件、萌發時間等因素來模擬田間低溫條件，室內萌發期的耐冷性鑒定結果與田間出苗情況的相關程度可以達到顯著水平以上，這為開展室內玉米萌發期耐冷性鑒定提供了必要的理論基礎[5-6]。室內鑒定的方法不受環境因素限制，可以根據需要設定溫度及含水量等條件，重復性好，特別適合對大量的材料進行鑒定。當前，室內鑒定已經成為萌發期耐冷性鑒定的重要方法。北美官方種子檢測協會（AOSA，Association of Official Seed Analysts）對玉米萌發期耐冷性的鑒定就是采用室內鑒定方法[7]。

2.2 直接鑒定和間接鑒定 根據評價指標的不同，玉米萌發期耐冷性鑒定方法又可以分為直接鑒定和間接鑒定2種方法。直接鑒定法主要考查種子萌發不同時期生長發育狀況、生長量以及達到不同生長發育階段的時間，如發芽率、出苗率、根長、莖長、根莖鮮重、干重等這些可以直接觀察或者簡單測量即可獲得的指標。間接鑒定法則是對與玉米耐冷性相關的生理生化指標進行測定，如相對電導率、酶活性、代謝物質含量等[8]。這些指標的測定涉及一系列的化學和物理過程，需要借助電導率儀、分光光度計、液相色譜等儀器設備，這些試驗過程相對于直接鑒定法較為繁瑣，耗時較長，進行大批材料鑒定時應用起來比較困難。

3 玉米萌發期耐冷性鑒定的指標研究

3.1 玉米生長發育和形態指標 玉米生長發育和形態指標可以大致分為3類，第一類是規定的時間點和時間段內達到某一生長發育階段的種子占供試種子的百分比，這些指標包括發芽率、發芽勢、相對發芽率、發芽指數等；第二類是一定時間點或時間段玉米生物量的描述，如根長、莖長、干重、鮮重等；第三類指標是統計玉米達到每一生長發育階段所需要的時間，如從播種到50%發芽時間，從播種到50%出苗的時間等。

發芽率是評價玉米萌發期耐冷性最基礎和最重要的指標，對發芽的判斷是計算玉米發芽率的基礎。由于對玉米萌發各時期的判斷和理解的標準不同，導致研究者在對發芽的判斷上存在較大的差異。張雪峰等[9]在試驗中以胚根伸出0.6mm為發芽標準，李波等[10]在統計發芽種子數時以胚根伸出0.5mm為標準，李俊明等[11]則以胚根長出2mm為標準記錄發芽數，馬延華[12]以胚根突破種皮長0.5cm作為發芽標準，E.Noli等[13]以胚芽鞘長度為2mm以上的種子來統計發芽率，張曉聰等[14]則以胚芽鞘長達至少1cm作為發芽的判斷標準。這些指標實際上反映了玉米種子在低溫條件下生長發育早期的萌動情況。北美官方種子檢測協會對發芽率的規定與我國種子檢驗規程的方法相類似，即統計正常幼苗占供試材料的百分比來評價玉米種子的萌發期耐冷性[7]。

在發芽率的基礎上又衍生出種子發芽勢、相對發芽率、發芽指數、相對發芽指數等指標，這些指標能反映的是在規定的時間點和時間段內萌發玉米百分比及其相對值，實際上是對低溫條件下玉米發芽能力定量的描述。低溫、高濕等不利條件對玉米生長發育速度、干物質的合成和積累產生重要的影響，造成各試驗材料在同一時間內胚根長或胚芽長、莖鮮（干）重、根鮮（干）重等方面存在著顯著的差異，這些都被用來作為耐冷性研究的評價指標[15]。

活力指數（Vi，vigor index）則綜合利用了第一類和第二類指標，公式為Vi=S×發芽率或者發芽指數，根據發芽的判斷標準不同，S可以是胚根、胚芽或者幼苗生長勢（如地上部分或根的平均鮮重或干重、胚根長或胚芽長等）。張雪峰等[9]采用的是10粒種子胚根的平均生長長度（mm）與發芽率的乘積為活力指數的指標，石海春等[16]將這個指標稱為簡易活力指數，劉春香等[6]則采用幼苗生長的平均鮮重與發芽指數的乘積來表示活力指數。

在如何選擇玉米萌發期耐冷性鑒定的生長發育和形態指標上目前尚未有統一的標準。扈光輝等[17]認為，相對發芽指數、相對發芽率、相對苗干重、相對根干重和相對根總長適宜作為玉米芽期和苗期耐冷性鑒定指標。張雪峰等[9]認為，相對發芽率、相對發芽勢、相對發芽指數和相對活力指數4項指標可以構建綜合活力指標。張曉聰等[14]的研究表明，相對發芽率、相對發芽指數、相對幼苗干重與相對活力指數呈極顯著相關，可以作為玉米自交系芽期耐冷性鑒定指標。鄭昀曄等[18]研究的相關性分析表明，相對發芽率、相對幼苗總干重、相對地上部苗干重、相對根干重之間顯著相關，是較好的耐寒性評價指標，并提出性狀相對值差異微小的自交系耐寒性強弱難以區分，采用聚類法將有關性狀綜合分析可以提供有效的借鑒。

3.2 生理生化指標 低溫會造成植物生物膜膜相的變化，增大膜的透性，降低酶活性，引起細胞生理生化過程的一些異常。當植物細胞膜被破壞后，大量電解質外滲，對電解質滲透率的測定是評價玉米萌發期耐冷性的一個重要指標。李霞等[19]研究表明，低溫條件下玉米吸脹期的電導率與常溫條件下的電導率的比值與發芽期耐冷性呈顯著正相關。過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）是植物組織防御系統中的重要保護性酶。楊靜[20]研究表明，在玉米萌發期初遇低溫時，SOD、POD、CAT 3種酶的酶活性均呈現出上升的趨勢。張毅等[21]也認為SOD活性下降的速率可以較好地反映出玉米耐冷性的差異。除過氧化物酶以外，丙二醛（MDA）的含量也能反映出活性氧對細胞膜系統造成的傷害程度，一般表現為耐冷性弱的自交系的MDA含量要高于耐冷性強的自交系[22]。

玉米萌發期耐冷性是一個極其復雜的性狀，它涉及一系列復雜的物質能量代謝活動和生理生化過程。與玉米生長發育和形態指標一樣，單一某一個生理生化指標往往也難以反映玉米萌發期耐冷性的強弱。近年來，廣大學者不斷嘗試在測定玉米生長發育和形態指標及生理生化指標的基礎上，將這些指標綜合起來分析以對玉米的萌發期耐冷性進行評價。彭云玲等[23]利用發芽期發芽率、胚芽長、胚根長、根數為隸屬函數法綜合評價指標篩選出了3份強耐寒玉米自交系。

4 影響玉米萌發期耐冷性鑒定的主要因素

4.1 溫度 溫度是玉米萌發期耐冷性鑒定首要考慮的因素。玉米是喜溫作物，對低溫非常敏感，其種子萌發、生長發育及干物質積累一般需要較高的溫度。隨著溫度的降低玉米萌發時間逐漸延長，多數研究結論表明，玉米種子萌發所需最低溫度為5～15℃[11，24]，不同材料間萌發的最低溫度存在較大的差異。選擇的溫度過高，則不能對玉米種子發芽產生足夠的選擇壓，溫度過低種子則會停止生長，難以達到鑒定目的[24]。因此，在確定耐冷性鑒定的溫度時一定要根據具體的試驗目的來進行選擇。當以育種為目的進行玉米耐冷性種質資源篩選時，應該適當采用相對較低的溫度或者設定溫度梯度逐級下調試驗的溫度。如扈光輝[24]對玉米種質資源進行篩選和鑒定時就分別設定了20℃、11℃和7℃ 3個溫度梯度從60份穩定系中篩選出7℃低溫條件下耐冷性強的種質5份，為玉米耐冷性育種奠定了基礎。法國利馬格蘭公司玉米室內萌發期耐冷性鑒定的方法是統計10℃7d～25℃3d條件下的發芽率，德國KWS公司則以5℃4d～25℃6d條件下的發芽率來評價玉米萌發期的耐冷性[6]。曹士亮等[25]最近研究發現，玉米5℃4d～25℃3d的發芽率分別與玉米的發芽勢和10℃21d（常用的低溫萌發處理條件）條件下的發芽率均呈顯著正相關。

4.2 水分 水分是玉米發芽的重要因素，也是影響玉米發芽的重要條件。水分通常與低溫一起造成玉米萌發期的冷害。J.K.Itabari等[26]研究表明，土壤水分含量對玉米種子萌發和出苗造成顯著的影響。孟憲新等[27]研究發現，當土壤含水量在15%～20%范圍內，玉米種子的發芽勢、發芽率和活力指數較高，適宜培育壯苗，并建議5%的土壤含水量為玉米種子萌發和苗期生長的最低預警水分。曹士亮等[25]研究發現，玉米種子的發芽勢在不同土壤水分含量間呈極顯著差異，品種的發芽率與土壤水分含量的互作呈極顯著差異，說明土壤水分含量對玉米種子萌發有重要的影響。北美官方種子檢測協會所制定的玉米耐冷性鑒定方法耐冷性檢測（Cold Test）和飽和耐冷性檢測（Saturated Cold Test）的差別，實際上就是依據玉米種子萌發過程中水分含量的不同，飽和耐冷性檢測通過在發芽基質下鋪上吸水紙，保障玉米整個低溫試驗過程都在充足的水分條件下，具有相對更嚴格的逆境脅迫[7]。

4.3 發芽基質 玉米種子發芽試驗（包括正常溫度和低溫條件）所采用的基質對種子的萌發起到提供支持和保水的作用。隨著人們對低溫發芽規律的認識和材料技術的發展，發芽基質也在不斷地變化。這些發芽基質主要包括沙子、沙子草炭土混合物、滅菌土、非滅菌土、紙卷以及近年來在國外廣泛使用的發芽紙。B.E.Clark[3]研究發現利用非滅菌土壤的耐冷鑒定能更好地預測早期播種的出苗率。我國學者常采用在培養皿內鋪放濾紙或吸水紙的方法來達到持續為種子萌發提供水分的目的。張同禎等[28]比較了玉米不同發芽方法的差別，發現采用先鋒公司的美國安科發芽紙的紙間法，重復間差異較小，易于實現操作標準化和管理規范化。近年來，蛭石因其吸水、保水性好以及易于統一規格而被廣泛地應用于玉米種子萌發試驗中。北美官方種子檢測協會的耐冷性鑒定主要采用蛭石為基質[7]。本實驗室采用培養皿和2層3mm厚黑色海綿進行萌發試驗，可以有效解決種子低溫萌發過程中長菌的問題。

5 對玉米萌發期耐冷性鑒定方法研究的展望

玉米萌發期耐冷性鑒定屬于玉米種子活力檢測的范疇，是玉米種子低溫萌發能力的體現。無論是耐冷性遺傳育種研究，還是在生產上對玉米耐冷性的鑒定，都期望能夠簡單、快速地獲得準確的試驗結果。因此，好的耐冷性鑒定的方法一般應該滿足以下幾個方面的要求。

5.1 方法簡便，鑒定周期短 玉米萌發期耐冷性鑒定試驗需要設置重復，一般需要同一批次處理樣本量大。簡便的試驗方法，一方面能夠縮短鑒定時間，快速獲得試驗結果，另一方面還有利于擴大試驗的規模，例如：法國利馬格蘭公司和德國KWS公司的萌發期耐冷性鑒定試驗周期均不超過2周[6]。

5.2 試驗可重復性好 好的萌發期耐冷性鑒定方法應該具有較好的可重復性，這樣有利于不同實驗室和不同研究人員的結果進行比較。為了實現試驗的可重復性，需要對試驗的條件確立作統一的規定。北美官方種子檢測協會所制定的玉米耐冷性檢測和飽和耐冷性檢測被多數的研究單位采用，低溫處理一般都是10℃7d，常溫的處理采用23℃和25℃不等，常溫處理時間上也存在5～7d的變化[7]。此外，在試驗的發芽基質和發芽的水分條件上目前也沒有統一的規定。由于細沙、田土等發芽基質很難統一規格，以一定規格蛭石為發芽基質較容易統一。因此，建議以統一規格的蛭石為發芽基質。

5.3 與田間低溫試驗的相關性 田間溫度、土壤水分等條件變化的不可控性限制了玉米萌發期耐冷性田間鑒定試驗的應用，特別是隨著試驗規模的增大，試驗環境更加難以協調一致。室內試驗可以有效地解決環境的差異，但開展室內鑒定試驗前要選擇一些耐冷性較為明確的試驗材料確定田間試驗與室內試驗相關性，使室內鑒定試驗的結果更具合理性。