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不同貯藏溫度下養殖大黃魚生物胺等品質變化規律研究

2018-01-17 08:34:43馮杰王徐媛傅玲琳王翀王海燕王彥波
食品研究與開發 2018年2期
關鍵詞:生物

馮杰,王徐媛,傅玲琳,王翀,王海燕,王彥波,*

(1.浙江工商大學食品與生物工程學院,浙江杭州310018;2.浙江工商大學浙江食品質量安全工程研究院,浙江杭州310018)

大黃魚口感鮮美營養價值高,是我國東南沿海最具商業價值的海洋品種,深受消費者喜愛。大黃魚死亡后,由于微生物的生長和酶的作用,體內一些蛋白質、氨基酸等含氮物質降解為生物胺、三甲胺等次級產物,使大黃魚在感官及品質上發生一系列不可逆轉的變化,這一過程即為腐敗過程[1-2]。研究表明,溫度是影響腐敗過程的重要因素[3-5]。

生物胺是一類具有生物活性的小分子含氮化合物的總稱,在微生物存在下,魚體內游離氨基酸脫羧和轉氨生成[6]。研究發現,生物胺的過量攝入對人體會造成損害[7-8]。國內外對淡水魚及海水魚貯藏過程中生物胺變化的研究很多:Fan等[9]測定青魚不同貯藏溫度下生物胺及其他品質指標,綜合指標得出青魚在20、4、0 ℃的貨架期分別為 2、9、12 d。Shi等[10]將不同貯藏條件下白鰱生物胺及其他品質指標進行相關性分析,發現腐胺可作為白鰱鮮度指標。Rodrigues等[11]發現腐胺和尸胺可作為0℃貯藏條件下虹鱒魚腐敗過程的質量指標。作為重要的養殖魚類,大黃魚的新鮮度備受關注,而對于大黃魚生物胺及品質相關性研究尚未見報道。因此對于大黃魚貯藏過程中生物胺的變化研究具有重要的現實意義。鑒于此,本研究以養殖大黃魚為對象,選擇室溫和冷藏兩種典型的貯藏溫度,即在25、4℃兩種貯藏溫度下,測定生物胺、菌落總數以及pH、揮發性鹽基氮、三甲胺等品質指標,并解析相應的變化規律。此外,通過建立典型生物胺的多元回歸預測模型,旨在闡釋大黃魚貯藏過程中品質指標之間的相互聯系,為評價養殖大黃魚不同貯藏溫度下的品質變化規律及安全控制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

養殖大黃魚(354.1±12.1)g:寧波象山養殖場;生物胺標品(色譜級)、丹磺酰氯(色譜級):美國Sigma公司;平板計數瓊脂(Plate count agar,PCA):青島海博公司;乙腈(色譜級)、氨水(色譜級):美國TEDIA公司;三氯乙酸、碳酸氫鈉、碳酸鎂及其他常規試劑:上海阿拉丁生化科技股份有限公司:實驗用水為超純水。

1.2 主要儀器與設備

1100高效液相色譜:美國Agilent公司;ST16R臺式冷凍高速離心機:美國Thermo公司;LRH-250恒溫培養箱:常州澳華儀器有限公司;DW-YL270低溫冰箱:中科美菱公司;KJELTEC 8400全自動凱氏定氮儀:丹麥FOSS公司;FE20精密pH計:梅特勒-托利多儀器上海有限公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺:上海博訊實業有限公司;Milli-Q超純水處理系統:美國Millipore公司;722可見光分光光度計:上海光學儀器廠;MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋:日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

養殖大黃魚分別裝入無菌樣品袋中,隨機分成兩組,分別放入4℃低溫冰箱及25℃恒溫培養箱中恒溫貯藏。在貯藏過程中,根據預試驗結果選擇適當的時間間隔對樣品取樣分析。

1.3.2 生物胺含量測定

參照李志君[12]、G.Vinci[13]的方法略作修改,取5 g魚肉,加入 10 mL 5%三氯乙酸(TCA),勻漿 2 min,室溫下振蕩提取60 min,4℃以3 600 r/min離心10 min,移出上清液后殘渣重復提取1次,合并上清液并定容至20 mL,過濾。濾液與正己烷(1∶1,體積比)混合振蕩,棄去上層有機相以除脂。除蛋白前加入氯化鈉使之飽和,取5 mL試樣,用氫氧化鈉調節pH值至12.0左右,加入5 mL正丁醇/三氯甲烷(1∶1,體積比)混合液,渦旋振蕩并離心,轉移上層有機相,重復1次,合并萃取液,用正丁醇/三氯甲烷(1∶1)混合液定容至10 mL,取5 mL加入 300 μL 1 mol/L鹽酸,混勻后用40℃水浴下氮氣吹干,加入1 mL 0.1 mol/L鹽酸溶解殘留物。隨后進行衍生過程,加入100 μL 2 mol/L NaOH溶液,再加入300 μL飽和碳酸氫鈉溶液進行緩沖,繼續加入2 mL 10 mg/mL的丹磺酰氯(丙酮配制),在黑暗條件下40℃反應40 min,加入100 μL 25%氨水靜置30 min終止反應。加入1.5 mL乙腈定容至5 mL,取1 mL試樣過0.22 μm有機濾膜,待測。

色譜條件:Cl8 柱(300×4.6 mm×5 μm,Agilent);流動相A為0.1 mol/L乙酸銨溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫,0 min~25 min,30%A→10%A;25 min~35 min,10%A。流速為0.8 mL/min;進樣量:20 μL;柱溫:30℃;檢測波長:254 nm。

1.3.3 其他品質指標測定

細菌總數(Total viable counts,TVC)測定參照 GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》,無菌條件下稱取25 g去鱗去皮的魚肉,加225 mL滅菌生理鹽水攪拌1 min,并充分搖勻,之后逐級稀釋至合適梯度傾注培養皿中混勻。揮發性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)測定,按 GB 5009.228-2016《食品中揮發性鹽基氮的測定》,使用全自動凱氏定氮儀測定。pH測定,按GB 5009.237-2016《食品pH值的測定》,使用pH計測定。三甲胺(Trimethylamine,TMA)測定,按Dyer的方法[14],稱取5 g樣品,加20 mL 5%TCA溶液,均質1 min,以4 000 r/min離心5 min,上清液過濾至50 mL定容瓶中,分別用20 mL,10 mL TCA溶液按上述操作提取兩次,合并濾液定容至50 mL。取5 mL濾液與10 mL無水甲苯、1 mL碳酸鎂-甲醛溶液和3 mL飽和碳酸鉀溶液充分混合并靜置10 min,吸出5 mL混合液與5 mL 0.02%苦味酸的甲苯溶液混勻,用分光光度計比色測定。

1.3.4 數據處理

試驗重復3次,結果用平均值±標準偏差表示,數據統計分析用SPSSversion21作相關性分析,以P<0.05作為差異顯著的要求,采用Prism 7繪畫軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同貯藏條件下大黃魚生物胺含量變化

生物胺含量變化如表1所示。

表1 不同貯藏溫度下養殖大黃魚生物胺含量變化Table 1 Biogenic amines variation in large yellow croaker at different storage temperature

生物胺含量變化受溫度影響很大,溫度越高,生物胺變化越快。在25℃貯藏溫度下,大黃魚體內腐胺和尸胺增長顯著,在貯藏終點分別達到75.56 mg/kg和806.00 mg/kg。腐胺和尸胺均是從24 h開始明顯增長。而其他生物胺在貯藏過程中雖然略有增多,但是變化不明顯。在4℃貯藏期間,腐胺和尸胺在貯藏前期增長緩慢,在第4天開始增長迅速,到達貯藏期終點時分別達到25.51 mg/kg和16.96 mg/kg,其他生物胺在貯藏期間也略有增加,但變化不大。在兩種貯藏溫度下,組胺含量到貯藏終點時分別為8.97 mg/kg,3.54 mg/kg,均未超過GB 2733-2015《食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品》對組胺含量≤200 mg/kg的限量。

2.2 不同貯藏條件下大黃魚TVC變化

不同貯藏溫度下養殖大黃魚TVC變化見圖1所示。

由圖1可以看出,微生物的生長速度受溫度影響很大。大黃魚初始菌落總數為3.22 lg(CFU/g),在25℃貯藏條件下,菌落總數增長迅速,在18 h TVC就已超過5 lg(CFU/g);4℃貯藏條件下的菌落生長速度次之,在第6天時達到5 lg(CFU/g)。根據SC 127-1984《鮮大黃魚鮮小黃魚》,大黃魚一級鮮度標準為菌落總數≤4 lg(CFU/g),二級標準為菌落總數≤5 lg(CFU/g)。因此,25℃和4℃貯藏溫度下大黃魚的菌落總數分別在18 h和6 d時超出二級標準,判定為腐敗。

圖1 不同貯藏溫度下養殖大黃魚TVC變化Fig.1 TVC variation in large yellow croaker at different storage temperature

2.3 不同貯藏條件下大黃魚TVB-N變化

大黃魚在不同貯藏溫度下的TVB-N值變化情況如圖2所示。

圖2 不同貯藏溫度下養殖大黃魚TVB-N變化Fig.2 TVB-N variation in large yellow croaker at different storage temperature

溫度對大黃魚TVB-N的影響很大。新鮮大黃魚的初始TVB-N值為6.48 mg/100 g,隨著貯藏時間的增長,兩個貯藏溫度下的大黃魚TVB-N值均呈明顯上升趨勢,其中25℃貯藏條件下,大黃魚TVB-N增加迅速,在接近貯藏終點36 h超過30 mg/100 g;其次是4℃貯藏條件,TVB-N先是平緩增加,而后接近貯藏終點時增加迅速,并在第10天達到31.8 mg/100 g,可能是由于隨著貯藏時間的延長,微生物數量逐漸增多,在微生物作用下,大黃魚體內氨基酸逐步降解成氨及其他胺類物質,TVB-N含量快速增加。根據SC 127-1984《鮮大黃魚鮮小黃魚》,大黃魚一級鮮度標準為TVBN≤13 mg/100 g,二級標準為TVB-N≤30 mg/100 g。因此,25℃和4℃貯藏條件下,大黃魚TVB-N含量分別在36 h和10 d超出二級標準,判定為腐敗。

2.4 不同貯藏條件下大黃魚pH值變化

大黃魚不同貯藏溫度pH值變化如圖3所示。

圖3 不同貯藏溫度下養殖大黃魚pH值變化Fig.3 pH variation in large yellow croaker at different storage temperature

在貯藏初期,兩個溫度下大黃魚pH值都略有降低,隨后25℃貯藏溫度下大黃魚pH值迅速上升;4℃溫度下大黃魚pH值上升一段時間出現小幅波動,而后繼續上升,有可能是由于微生物處于對數末期,微生物生長活躍,并產生一些酸性代謝產物,之后由于繼續降解魚體內蛋白質而使pH值繼續增長。

2.5 不同貯藏條件下大黃魚TMA變化

大黃魚不同貯藏溫度下TMA變化如圖4所示。

圖4 不同貯藏溫度下養殖大黃魚TMA變化Fig.4 TMA variation in large yellow croaker at different storage temperature

新鮮大黃魚初始TMA含量幾乎為0 mg/kg,25℃貯藏溫度下TMA升長迅速;4℃貯藏溫度下TMA在貯藏初期平緩增長,接近貯藏終點時增長迅速,這和TVB-N的增長趨勢相同。

2.6 生物胺變化與其他理化指標相關性

生物胺與TVC、pH值、TVB-N、TMA的相關性見表2所示。

根據表2測定的腐敗指標結果,對不同貯藏溫度下大黃魚的生物胺和TVC、pH值、TVB-N、TMA進行皮爾遜相關性分析。結果表明,25℃和4℃貯藏期間,腐胺和尸胺與TVC、pH值、TVB-N、TMA這些品質指標都呈高度正相關。由生物胺產生情況來看,腐胺和尸胺在25℃和4℃貯藏過程中生成量大,變化趨勢明顯,且與各項品質指標高度相關。表明在這兩種貯藏溫度下,腐胺和尸胺與大黃魚腐敗過程關系緊密,可作為評價大黃魚在這兩種貯藏溫度下品質的指標之一。

表2 生物胺與TVC、pH值、TVB-N、TMA的相關性Table 2 Correlation of biogenic amines and TVC,pH,TVB-N,TMA

為進一步探討25℃和4℃貯藏溫度下生物胺及其他品質指標之間的內部關系,分別以TVC、pH值、TVB-N、TMA為自變量,腐胺和尸胺為因變量進行回歸分析,建立25℃和4℃的回歸模型如圖5所示。

圖5 生物胺與其他品質指標回歸方程Fig.5 Regression equations of biogenic amines and other quality indicators

其中,25℃貯藏溫度下腐胺含量與各品質指標的回歸系數由高到低分別為:TMA>TVC>pH值>TVB-N(R2為0.750 2~0.963 5),尸胺含量與各品質指標的回歸系數由高到低分別為:TMA>pH值>TVB-N>TVC(R2為0.731 6~0.932 3),4℃貯藏溫度下腐胺含量與各品質指標的回歸系數由高到低分別為:pH>TMA>TVBN>TVC(R2為 0.864 5~0.898 0),尸胺含量與各品質指標的回歸系數由高到低分別為:TVC>TVB-N>TMA>pH值(R2為0.803 5~0.915 9)。在 25℃和4℃儲藏溫度下大黃魚體內腐胺和尸胺含量與各品質指標的回歸系數均大于0.7,可以判定在大黃魚的腐敗過程中腐胺和尸胺與腐敗進程有密切的關系,且腐胺和尸胺可作為判斷大黃魚腐敗進程的指標之一。

2.7 生物胺預測模型

由表2得出,大黃魚貯藏期間腐胺和尸胺與其他品質指標有著高度的相關性,因此可以用其他品質指標來表征生物胺含量,從而方便預測大黃魚貯藏過程中生物胺的變化情況。將樣本數據導入SPSS 21中,分析所有樣本的腐胺、尸胺與TVC、pH值、TVB-N、TMA的Pearson相關性,均表現出有相關性(P均<0.05,結果未列出),進而進行多元線性回歸分析,建立回歸方程。y1,y2,x1,x2,x3,x4分別代表腐胺、尸胺、TVC、pH 值、TVB-N、TMA,回歸方程如下:

回歸方程(1)的 R2為 0.915,P<0.01,回歸方程(2)的R2為0.766,P<0.01?;貧w方程具有統計學意義,說明將TVC、pH值、TVB-N、TMA結合預測腐胺和尸胺效果較好。

模型驗證另取一組兩個溫度下的貯藏大黃魚各指標數據,隨機選取15個數據代入上述公式求出預測值與原數據進行回歸分析,結果如圖6所示。

腐胺和尸胺回歸系數R2分別為0.940和0.963,且用單變量線性模型檢驗擬合直線與方程y=x不顯著,證明預測值與實際值差別不大,此模型可用于大黃魚貯藏過程中腐胺和尸胺含量的預測。

圖6 模型驗證Fig.6 Verification of models

3 結果與討論

生物胺是一類具有生物活性的含氮類化合物,不同水產品可生成的生物胺種類和數量都差別很大,組胺和酪胺具有毒性,而腐胺和尸胺的存在可能增加毒性作用[15]。而新鮮水產品體內不含或只含少量生物胺,其含量會隨著水產品的死后貯藏而變化,因此,可以將生物胺作為水產品品質指標之一[16]。不同品種,或是不同來源的同一品種之間生物胺含量差異也很大,可能由于不同的生長環境或者不同微生物導致[17]。包玉龍等[18]研究發現鯽魚在冷藏和冰藏過程中色胺和腐胺隨時間增長明顯;劉壽春等[19]分析羅非魚在冷藏過程中,腐胺和尸胺快速增長;郭慧等[19]發現小黃魚在不同貯藏環境下腐胺、尸胺、組胺和酪胺均隨著貯藏時間而增加。本實驗中,25℃和4℃貯藏環境腐胺和尸胺均增長明顯,且25℃下尸胺含量達到806.00 mg/kg,可能是因為大黃魚體內賴氨酸含量比較充裕且此溫度適宜某些微生物生長,促進賴氨酸脫羧酶的活性。

微生物指標是衡量水產品新鮮程度的主要指標之一。水產品腐敗過程中微生物的作用是最主要原因。大黃魚貯藏過程中,25℃和4℃菌落總數均成S形生長曲線,可能是因為前期魚體處于僵直階段,蛋白質呈大分子狀態,微生物無法利用,而后蛋白質被酶分解為小分子蛋白,微生物能夠很好的利用,從而生長迅速[20]。在后期可能因為魚體內營養物質限制,微生物生長速度降低。

TVB-N是在微生物作用下,大黃魚體內蛋白質被分解成具有揮發性的氨、伯胺、仲胺等次級堿性含氮物質的總稱[21]。TVB-N的含量通常被用于判定水產品腐敗程度的指標之一[22]。此研究中TVB-N先慢后快的變化趨勢與菌落總數變化一致,這是因為TVB-N主要受微生物的影響。Qin等[23]對草魚的研究中,草魚初始TVB-N含量為9 mg/100 g,本研究中大黃魚初始含量6.48 mg/100 g與之一致,且都是高菌落總數時期對應高TVB-N含量。

pH值在一定程度上能反應水產在貯藏過程中的新鮮程度,新鮮魚在死亡初期,體內發生糖原酵解,產生乳酸等酸性物質使魚肉pH值降低,之后由于體內蛋白質在微生物作用下形成氨氣及胺類堿性物質,導致pH值上升[24-25]。Alparslan等[26]認為,新鮮魚體pH值在6.0~6.5之間,可接受的上限一般為6.8~7.0。此次研究中,大黃魚貯藏初期pH值為6.16,與Alparslan觀點符合,在貯藏終點時,4℃和25℃下大黃魚pH值均略低于6.8,可能與品種、生活狀態、季節等有關。

三甲胺是在水產品貯藏過程中,在腐敗微生物作用下,使體內氧化三甲胺降解為三甲胺,是水產品腥臭味的主要來源,因此可以用來作為判斷水產品的品質指標之一[27]。且TMA作為TVB-N的主要成分之一,其含量變化與TVB-N緊密聯系[28]。在本次試驗中,大黃魚體內TMA含量在4℃及25℃均變化明顯,變化趨勢與OLA等[29]、Okoro等[30]結果一致,均是前期增長相對較慢,后期增長快速。

很多研究水產品保鮮技術,主要參照指標都為TVC、TVB-N、菌落總數等,對生物胺的影響往往單獨研究,而生物胺產生與微生物活動相關聯,因此是腐敗過程不可忽視的指標。Bilgin等[31]通過研究幾種水產品中生物胺形成和TBA、TVB-N、pH值及蛋白質的關系,發現TVB-N與尸胺、酪胺、組胺顯著正相關;郭慧等[32]分析不同貯藏溫度下小黃魚、米魚及帶魚生物胺與其他新鮮指標的相關性,得出3種海產品的特征生物胺;李苗云等[33]研究發現尸胺也作為判斷豬肉腐敗過程的重要變量。本實驗中,通過多元回歸分析發現腐胺和尸胺可作為大黃魚腐敗指標之一,且通過進一步的線性回歸,建立了兩種生物胺與其他品質指標的內在聯系模型,并通過驗證可用。

本文研究了兩種貯藏溫度下大黃魚TVC、pH值、TVB-N、TMA的變化,得出25℃和4℃下大黃魚的貨架期分別為18 h和6 d。通過研究發現,溫度對不同生物胺的影響差異也很巨大,對大黃魚而言,腐胺和尸胺受溫度時間影響最為顯著,且溫度越高產生越快。將腐胺和尸胺與其他品質指標做相關性分析,表明腐胺和尸胺與大黃魚腐敗過程關系緊密,可作為判定大黃魚貯藏過程中品質指標之一。將腐胺和尸胺與其他品質指標建立多元回歸方程,方程在統計學意義上顯著,并對方程進行驗證。可以更進一步闡明大黃魚貯藏過程中腐胺和尸胺與腐敗過程之間的關聯,為以后對于生物胺形成機理的研究提供理論基礎,對客觀評價大黃魚貯藏期間的品質變化及對其安全控制有重要意義。

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