水熱法提取金銀花中綠原酸的工藝研究

李杰，陳道鴿，王兵兵，王學廷

（河南科技大學醫學院，河南洛陽471023）

綠原酸（Chlorogenic Acid，CA）是一種縮酚酸，在植物中經莽草酸途徑形成的一類苯丙素類化合物[1]，是國際公認的“植物黃金”[2]。現代藥理學研究表明，綠原酸具有多種藥理活性[3]，如抗腫瘤、降血壓、抗病毒等。同時，綠原酸還作為食品添加劑和植物生長激素，廣泛應用于食品和化妝品行業[4-5]。鑒于綠原酸具有多種藥理活性和廣闊的應用領域，因此如何有效的從植物中進行提取越來越受到人們的關注。目前國外主要從咖啡豆中[6]提取綠原酸，而國內多以金銀花為原料進行提取。金銀花原產我國，具有清熱解毒、疏散風熱的功效，并且作為經濟作物在各省都有大規模的人工種植區，資源豐富。

目前金銀花中綠原酸的提取按照提取溶劑分類可大致分為水提法、有機溶劑提取法[7-8]和二氧化碳超臨界萃取法[9]。從經濟方面考慮水提法較為理想、實際，但是傳統的水提法都是在開放的體系中進行提取，存在提取時間長、得率低等問題。近幾年來發展起來的亞臨界水提取[10]技術在一定程度上克服了傳統水提法的不足，但設備比較昂貴，主要由高壓注射泵、恒溫爐、預加熱器、萃取罐、冷卻器及萃取接受等裝置組成[11]，提取成本較高。因此，有必要建立一種簡便、經濟、高效的水提法來提取金銀花中的綠原酸。

水熱法[12]是納米材料合成[13-14]的一種常用方法，但在中藥活性組分提取方面的應用研究還鮮見報道。其原理主要是以水為反應介質，通過對密閉的反應體系加熱，在體系內部創造一個高溫、高壓的反應環境，使水處于亞臨界（溫度介于100℃～374℃之間）或超臨界（溫度高于374℃）[15]狀態，從而表現出高活性、高傳質速率的特點。該方法具有設備簡單、操作簡便、無污染等優點。因此，本研究通過單因素試驗探討了液料比、提取溫度以及提取時間對金銀花中綠原酸得率的影響，并在此基礎上進行Box-Behnken中心組合設計，以綠原酸的得率為響應值，對該提取工藝進行了優化，以期為綠原酸的提取提供一種新途徑、新方法，同時為金銀花的開發利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料

金銀花：洛陽中藥材批發市場（粉碎過80目篩），經河南科技大學王學廷副教授鑒定，均為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾；綠原酸標準品（質量分數為99.0%）：上海金穗生物科技有限公司；甲醇、乙腈、磷酸（均為色譜純）：天津市巴斯夫化學試劑有限公司。

1.2 儀器

天美LC2000液相色譜儀：上海天美科學儀器有限公司；CT14RD高速離心機：上海天美生化儀器設備有限公司；BT125D雙量程電子分析天平：德國多利斯公司；聚四氟乙烯內襯的不銹鋼反應釜：福建物質結構研究所；PHG9246A烘箱：上海精宏實驗設備有限公司。

2 方法

2.1 綠原酸的測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.4%磷酸（13∶87，體積比）；檢測波長：327 nm；進樣量：20 μL；流速：1.0 mL/min；柱溫：室溫。

2.1.2 標準工作曲線的配制

精密稱取綠原酸標準品10 mg，50%甲醇溶液溶解，并定容于50 mL棕色容量瓶中，逐級稀釋為5、10、20、30、40、50 μg/mL 的綠原酸標準溶液。在“2.1.1”色譜條件下進行測定綠原酸的峰面積，以各濃度為縱坐標（Y），峰面積為橫坐標（X）進行線性回歸計算，得綠原酸標準品回歸方程。

2.1.3 供試品溶液的制備及測定

按照料液比稱取金銀花粉末于18 mL水混合于水熱釜中，密封反應釜并置于一定溫度的烘箱內進行提取。提取結束后，自然冷卻至室溫，移取提取液2.00 mL以10 000 r/min離心分離5 min，取上清液0.20 mL于10 mL棕色容量瓶內，50%甲醇定容，0.45 μm濾膜過濾，取續濾液作為供試液，高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC） 法測定綠原酸的含量。

根據回歸方程計算提取液中綠原酸的濃度，按公式計算綠原酸得率。改變提取條件，考察液料比、提取溫度以及提取時間對綠原酸得率的影響。

式中：C為提取液中綠原酸的濃度，μg/mL；V為提取液的體積，mL；n為稀釋倍數；M為金銀花質量，g。

2.2 單因素試驗設計

選取液料比 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）5 個水平；提取溫度 80、90、100、110、120、130℃ 6個水平以及提取時間 10、20、30、40、50 min 5 個水平分別進行單因素試驗。

2.3 Box-Behnken響應面法試驗設計

綜合單因素影響的試驗結果，根據Box-Behnken試驗設計原理，通過Design Expert 8.0.5統計分析軟件的響應面分析法安排試驗，優選水熱法提取的最佳工藝參數。采用三因素三水平進行試驗設計，水平編碼見表1。

表1 Box-Behnken效應面法因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken response surface method

2.4 數據分析

金銀花中綠原酸提取試驗平行進行3次，取平均值，然后利用Origin8.0和Design Expert 8.0.5軟件進行作圖和統計分析。

3 結果與討論

3.1 標準品及供試品的色譜圖

圖1是綠原酸標準品、供試品以及空白溶劑的高效液相色譜圖。

從圖1中可以看出，在“2.1.1”的色譜條件下，供試液中的綠原酸和雜峰在12 min內實現了良好分離，且峰形對稱不拖尾。綠原酸標準品的質量濃度Y與峰面積 X 的回歸方程為：Y=2×10-5X+0.314 2，R2=0.999 9，線性關系良好。

圖1 供試品溶液（A）綠原酸標準品溶液（B）空白溶劑（C）的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC of reference sample（A），reference substance（B）and 50%methanol（C）

3.2 方法學考察

3.2.1 精密度試驗

取同一個綠原酸標準溶液，連續進樣6次，以綠原酸的峰面計，綠原酸的RSD為1.42%，說明儀器的精密度良好。

3.2.2 重復性試驗

取金銀花粉末 0.8 g，液料比為 20 ∶1（mL/g），提取溫度90℃，提取時間30 min，平行提取6份，在“2.1.1”色譜條件下進行檢測，綠原酸峰面積的RSD值為1.39%，說明水熱法提取綠原酸的重復性和穩定較好。

3.2.3 穩定性試驗

取同一份供試液樣品，在上述的色譜條件下，分別于配置后0、2、4、6、24 h進樣，記錄綠原酸的峰面積，RSD值為0.60%，表明供試液液在24 h內穩定。

3.2.4 回收率試驗

精密量取0.5mL已知含量（綠原酸含量為0.545mg）供試液于50 mL容量瓶中，分別加入綠原酸對照品溶液（2.18 mg/mL）0.4、0.5、0.6 mL，按照低、中、高制備3組，平行測定3次，測得綠原酸平均加樣回收率為96.58%，RSD=1.89%，說明該方法準確可靠。

3.3 單因素試驗

3.3.1 液料比對綠原酸得率的影響

在提取溫度為110℃，提取時間為20 min，液料比為 10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g）進行試驗，探討液料比綠原酸得率的影響，結果如圖2所示。

由圖2可知隨著液料比增大，綠原酸得率呈現先升高后下降的趨勢。這是因為隨著提取溶劑體積的增大，金銀花粉末與水的接觸面積增大，使得綠原酸的得率逐漸升高，當液料比為30∶1（mL/g）時，綠原酸得率最大。超過30∶1（mL/g）后，綠原酸得率逐漸降低，這可能是由于當液料比為30∶1（mL/g）g時，在此提取條件下，金銀花中的綠原酸已經完全提取出來，如果繼續擴大液料比只會稀釋提取液中綠原酸的濃度，從而表現為綠原酸的得率降低。因此，選擇液料比為30∶1（mL/g）較為合適。

圖2 液料比對綠原酸得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on CA extraction yield

3.3.2 提取溫度對綠原酸得率的影響

選擇試驗條件為液料比30∶1（mL/g），提取時間20 min，提取溫度控制為 80、90、100、110、120、130 ℃，討論提取溫度對綠原酸得率的影響。結果如圖3所示。

圖3 提取溫度對綠原酸得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on CA extraction yield

從圖3中可以看出在80℃～110℃范圍內，隨著提取溫度的升高，綠原酸的得率也逐步提高。當提取溫度為110℃時，綠原酸得率最高。一方面是由于溫度的升高，加快了分子的擴散速度，使溶劑和固體組織充分接觸，促進了整個提取過程的質量轉移。此外提取溫度超過100℃，水處于亞臨近狀態，與普通水相比，水的介電常數、表面張力和黏度都顯著降低，水分子之間的氫鍵減弱，極性減小[16]，提高了綠原酸在水中的溶解性和傳質系數。同時，溫度的升高也致使提取體系內的飽和蒸汽壓升高，壓力的升高有助于提高水對基質的穿透能力，縮短溶劑在基質的提取速度[17]，從而提高綠原酸的溶出速度。當提取溫度超過110℃時，綠原酸的得率開始降低，這可能是由于較高的溫度和壓力導致綠原酸分解所致。

3.3.3 提取時間對綠原酸得率得影響

固定液料比 30 ∶1（mL/g），提取溫度為 110 ℃，選取 10、20、30、40、50 min 進行試驗，考察提取時間對綠原酸得率得影響。結果見圖4。

圖4 提取時間對綠原酸得率的影響Fig.4 Effect of different extraction time on CA extraction yield

由圖4可知，水熱法提取10 min～30 min時，隨著時間的延長，提取液中綠原酸的含量不斷增加，超過30 min時，綠原酸的含量趨于平穩。這是由于在提取的初期，金銀花中的綠原酸未被完全溶解出來，隨著時間的延長，綠原酸逐漸被全部溶解出來并擴散到提取溶劑中，直至達到平衡。因此，提取時間宜控制在30 min左右。

3.4 Box-Behnken法試驗結果與分析

采用Design Expert 8.0.5軟件進行試驗設計和結果分析，結果見表2。

表2 金銀花中綠原酸得率得響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

通過對試驗結果進行響應面分析，經過二次回歸擬合，得出擬合方程為：

Y=3.24-0.044A+0.13B-0.049C-0.11AB+0.13AC+0.045BC+0.038A2-0.060B2+0.053C2。

響應面分析法對綠原酸得率得ANOVA分析見表3。

表3 響應面分析法對綠原酸得率得ANOVA分析Table 3 ANOVA of the constructed regression model

表3對回歸方程進行了方差分析，從中可以看出，各個因素對金銀花中綠原酸得率影響的主次順序為B>C>A，即提取溫度＞液料比＞提取時間。3個因素對綠原酸得率影響顯著程度排序為：AC>AB>BC。P值的大小表明模型及各考察因素的顯著水平。P值小于0.05，表明模型或各因素有顯著影響；P值小于0.01表明模型或各因素高度顯著[18]。由表3可知，以綠原酸得率為響應值時，模型P=0.000 8＜0.010 0，表明該二次方程模型高度顯著。同時失擬項P=0.598 4＞0.100 0，說明試驗結果與數學模型擬合良好，可利用該數學模型預測試驗結果，擬合方程的相關系數R2=0.981 4，與校正系數Adj.R2=0.947 9相近，表明綠原酸得率得預測值與實測值有較好的擬合度。變異系數（CV）為1.09%，也說明模型的置信度較高，模型方程能夠很好的反映真實試驗值，利用該回歸方程可以確定水熱法提取金銀花中綠原酸的最佳工藝條件。

以擬合的目標函數為數學模型，繪制因變量的曲面和等高線圖，見圖5。

等高線圖表示提取時間、提取溫度、液料比這3個因素中任意一個變量取零水平時，其余兩個變量對綠原酸提取率的影響。從圖中可以看出提取溫度對綠原酸提取率影響最顯著，表現為曲線比較陡峭，提取時間和液料比次之，表現為曲線較平滑。應用Design Expert 8.0.5軟件求導，可得水熱法的最佳提取條件為：提取時間20 min，提取溫度為120℃，液料比為20∶1（mL/g），在此條件條件下，綠原酸得率的預測值為3.69%。

圖5 提取溫度、提取時間和液料比交互作用對綠原酸得率的響應面及等高線Fig.5 Response surfaces plots and contour line of effects of interactions between extraction temperature,extraction time and liquid-solid ratio on yield of CA

3.5 驗證試驗

根據最佳提取條件，平行提取3份，將結果與二項式擬合方程的預測值進行比較。計算偏差：偏差=（預測值-實測值）/預測值×100%，結果如表4所示。

表4 驗證試驗結果Table 4 Results of verification test

從表中可以看出，優選的水熱法提取工藝穩定，重現性好，預測值與真實值的偏差較小，說明利用響應面法優化得到的綠原酸水熱法提取工藝條件可信。同時將水熱法與《中國藥典》中采用的超聲波法進行了對比，超聲法的得率分別為3.29%、3.21%和3.24%，平均得率為3.25%，水熱法得率明顯高于超聲法，且所用的溶劑價廉、安全環保。

4 結論

本研究將水熱法應用于綠原酸的提取，是一種新的探索。相對于有機溶劑提取，水是一種綠色環保而又價廉的提取溶劑，通過調控提取溫度使水處于亞臨界狀態，有效的降低了水的極性和黏度，促進了目標物的溶出速度，提高了提取效率。同時，采用Box-Behnken試驗設計對水熱法提取工藝進行了優化，通過探討液料比、提取溫度以及提取時間對綠原酸得率的影響，發現提取溫度對綠原酸得率的影響最大，其次是液料比，提取時間影響最小。水熱法提取綠原酸的最佳工藝參數為：提取時間20 min，提取溫度120℃，液料比20∶1（mL/g），在此條件下，綠原酸的得率為3.60%與預測值3.69%基本相符，表明利用響應面法優化得到的水熱法提取工藝具有良好的可行性。與超聲提取工藝相比，水熱法具有省時、高效、環保等優點。該提取方法的建立為綠原酸的提取以及金銀花的開發、利用提供了參考，同時為植物中活性物質的提取提出了一種新方法。

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