菠蘿皮總黃酮和多糖雙水相同時(shí)提取的研究

侯巧芝，信建豪，劉子敬

（黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州450063）

黃酮類化合物是一類廣泛存在植物中的多酚類物質(zhì)，有抗菌[1]、抗氧化[2]等多種生物活性。多糖是由十個(gè)以上單糖聚合形成的高分子聚合物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等多方面非特異治療作用[3]。雙水相體系是由高聚物-高聚物或高聚物-低分子鹽形成的雙液體系，上相為有機(jī)溶劑相，下相為鹽水相。因該體系具有技術(shù)簡(jiǎn)單、分離速度快、易于純化，利于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)[4]，成為目前天然產(chǎn)物活性成分提取的研究熱點(diǎn)[5]。

本研究以菠蘿加工過程中副產(chǎn)物菠蘿皮為研究對(duì)象，采用雙水相同時(shí)提取產(chǎn)物中的黃酮和多糖。根據(jù)黃酮類物質(zhì)易溶于醇相（上相），多糖易溶于水相（下相）的特點(diǎn)，以乙醇-磷酸氫二鉀為萃取介質(zhì)，利用乙醇-磷酸氫二鉀雙水相體系同時(shí)研究菠蘿皮中黃酮和多糖的最佳提取工藝，該法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，以期為雙水相提取天然產(chǎn)物中黃酮和多糖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

菠蘿皮：鄭州市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采購(gòu)。取皮約2 mm～3mm厚度，洗凈后于烘箱50℃烘干，粉碎過80目篩后裝瓶備用。

TU-1810紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；XFB-200粉碎機(jī)：吉首市中誠(chéng)制藥機(jī)械廠；KQ-300V型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

無水乙醇、NaNO2、Al（NO3）3·9H2O、NaOH、濃H2SO4、K2HPO4·3H2O、C6H5OH：均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（GR）、葡萄糖（GR）：上海阿拉丁試劑網(wǎng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菠蘿皮黃酮和多糖的主要提取流程

菠蘿皮→粉碎→雙水相萃取→抽濾→分液→取上下相測(cè)吸光度A

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.2.2.1 黃酮[6]

稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品37.5 mg置于25 mL容量瓶中加雙水相上相溶解后定容，搖勻得1.5 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1、2、3、4、5 mL 于10 mL容量瓶中，加入本試驗(yàn)用雙水相上相溶液補(bǔ)足至約5 mL，然后依次加入5%亞硝酸鈉0.3 mL搖勻避光5 min，加入10%硝酸鋁0.3 mL搖勻避光5 min，最后加入4%氫氧化鈉后用上相溶液定容，搖勻后避光15 min后于510 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.2 多糖[7]

稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品100 mg置于100 mL容量瓶中用雙水相下相定容，搖勻得1 mg/mL的多糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于試管中，用雙水相下相溶液補(bǔ)足至2 mL，搖勻后分別加入6%苯酚1 mL和98%濃H2SO45 mL后搖勻，冷卻至30℃，以葡糖糖為0的那組作為空白對(duì)照。對(duì)該6組溶液按體積比1∶50進(jìn)行稀釋，在490 nm處測(cè)定稀釋后溶液的吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 菠蘿皮中黃酮和多糖的分離提取

取1.0 g菠蘿皮粉末按料液比1∶30（g/mL）加至30 mL雙水相體系中，其雙水相用40%磷酸氫二鉀溶液和無水乙醇體積比7∶3配置的，在30℃溫度下超聲提取20 min，過濾后分液，分別取上下相利用1.2.2.1項(xiàng)方法測(cè)定黃酮的吸光度A；多糖的測(cè)定是先用sevage法除去蛋白，然后再利用1.2.2.2項(xiàng)方法測(cè)定多糖的吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算黃酮和多糖的含量。

1.2.4 菠蘿皮中黃酮和多糖萃取率的測(cè)定[8-9]

黃酮萃取率Y/%=RK/（1+RK）×100，多糖萃取率Y/%=1/（1+RK）×100

式中：K為黃酮或多糖在兩相中的分配系數(shù)；C上，C下分別為黃酮或多糖上下相的濃度，mg/mL；R為上下相的體積比；V上和V下為上下相體積，mL。

1.2.5 樣品含量測(cè)定[10]

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總黃酮濃度，利用下式計(jì)算黃酮得率：

式中：C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的黃酮的濃度，mg/mL；V1為提取液的體積，mL；V2為顯色反應(yīng)的定容體積，mL；V3為測(cè)定取樣體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3 單因素試驗(yàn)

在1.2.3項(xiàng)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，保證其他條件相同的情況下改變其中的一個(gè)條件，分別考察料液比[1∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）、溫度（10、20、30、40、50、60℃）、乙醇的體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%、90%、100%）和磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)（30%、40%、50%、60%）對(duì)萃取率的影響。

1.4 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上確定其中主要4個(gè)影響因素，然后設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)，分別確定菠蘿皮總黃酮和多糖提取的最優(yōu)工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酮和多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

以蘆丁濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)x，吸光度A為縱坐標(biāo)y，得到回歸方程為y=0.093 78x+0.005 2，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1，在濃度0～0.75 mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。以多糖濃度C（μg/mL）為橫坐標(biāo)x，吸光度A為縱坐標(biāo)y，得到回歸方程為y=670.05x－0.011 1，其相關(guān)系數(shù)R2為0.999 0，在濃度0～2.5 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 料液比對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響

料液比對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響Fig.1 Effect of solid liquild rate on the extraction rate of flavonoids and polysaccharides

從圖1可知，黃酮萃取率呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，萃取率達(dá)到最大為83.67%，之后又逐漸減小。多糖的萃取率則先隨著料液比的增大有少許降低，料液比為1∶30（g/mL）后又增加，但料液比1∶50（g/mL）后萃取率基本不變。據(jù)此正交試驗(yàn)中料液比黃酮選擇的3個(gè)水平分別為1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），多糖選擇的 3水平分別為 1∶35、1∶40、1 ∶45（g/mL）。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響見圖2。

從圖2知，超聲時(shí)間在20 min內(nèi)黃酮和多糖的萃取率基本不變，之后緩慢地降低，可能原因超聲時(shí)間影響了上下相的組成，使得黃酮和多糖的萃取率均緩慢的降低。總體上看，超聲時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)萃取率的影響不大，說明超聲20 min內(nèi)黃酮和多糖已從粉末中溶出。所以正交試驗(yàn)沒有把該因素作為考察對(duì)象，本試驗(yàn)超聲提取時(shí)間均為20 min。

2.2.3 溫度對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響

溫度對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響見圖3。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of flavonoids and polysaccharides

圖3 溫度對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響Fig.3 Effect of temperature on the extraction rate of flavonoids and polysaccharides

從圖3看，黃酮萃取率隨著溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，30℃萃取率最大為89.82%，之后緩慢減小。多糖萃取率則隨著溫度的升高不斷地增大，50℃以后萃取率基本保持不變。推測(cè)引起該變化的可能原因是溫度的升高影響雙水相上下相的組成。故正交試驗(yàn)中溫度黃酮選擇的3個(gè)水平分別為30、40、50℃，多糖選擇的3個(gè)水平分別為40、50、60℃。

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)乙醇體積分?jǐn)?shù)在60%以下的與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%磷酸氫二鉀不能形成雙水相。故本試驗(yàn)僅選擇60%、70%、80%、90%、100%5個(gè)乙醇體積分?jǐn)?shù)作為單因素考察。乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響見圖4。

從圖4看，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加黃酮萃取率增大，乙醇體積分?jǐn)?shù)100%黃酮萃取率最高為73.56%。對(duì)多糖而言，萃取率則隨著乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。可能的原因可能是適量乙醇的存在增加了脂溶性多糖的溶出。故正交試驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)黃酮選擇的3個(gè)水平分別為100%、95%、90%，多糖選擇的3個(gè)水平分別為70%、75%、和80%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響Fig.4 Effect of ethanol solution concentration on the extraction rate of flavonoids and polysaccharides

2.2.5 磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)30%以下的磷酸氫二鉀與無水乙醇不分層，60%以上的磷酸氫二鉀與無水乙醇形成的雙水相，上相體積過少，故本試驗(yàn)僅選取磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、60%作為單因素考察的對(duì)象。磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響見圖5。

圖5 磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黃酮和多糖萃取率的影響Fig.5 K2HPO4mass fraction effect on the extraction rate of flavonoids and polysaccharides

從圖5知，黃酮萃取率隨著磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而減小，多糖的萃取率則隨著磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增大。故正交試驗(yàn)磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)黃酮選擇的3水平分別為30%、35%、40%，多糖選擇的3水平分別為50%、55%、60%。

2.3 正交試驗(yàn)

黃酮和多糖超聲提取時(shí)間均為20 min，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）、提取溫度（D）作為正交試驗(yàn)的4個(gè)因素，每個(gè)因素考察3個(gè)水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表。黃酮提取因素水平選取見表1，結(jié)果如表2。多糖提取因素水平選取見表3，結(jié)果如表4。

表1 黃酮正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Orthogonal experiment factors and levels table of the flavonoids

表2 黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Orthogonal experiment results and analysis table of the flavonoids

表3 多糖正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 Orthogonal experiment factors and levels table of the polysaccharides

由表2黃酮正交試驗(yàn)結(jié)果看，影響黃酮萃取率的主次順序?yàn)椋築＞D＞C＞A，最優(yōu)水平為 A2B3C1D3，即乙醇分?jǐn)?shù)為95%，料液比為1∶30（g/mL），磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，提取溫度為50℃。由表4多糖正交試驗(yàn)結(jié)果看，影響多糖萃取率的主次順序?yàn)椋篋'＞A'＞C'＞B'，最優(yōu)水平為A'1B'3C'2D'3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶45（g/mL），磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，提取溫度為60℃。

表4 多糖正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 4 Orthogonal experiment results and analysis table of the polysaccharides

2.4 工藝驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果，分別精密稱取菠蘿皮粉末2 g分別在黃酮和多糖正交試驗(yàn)最優(yōu)提取工藝條件下進(jìn)行萃取，平行3份，提取次數(shù)3次，得到黃酮和多糖平均萃取率分別為88.64%和86.91%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.62%和1.05%，得率分別為21.33 mg/g和18.95 mg/g。說明工藝條件穩(wěn)定可行，結(jié)果重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

本研究以萃取率為指標(biāo)，采用超聲輔助磷酸氫二鉀-乙醇雙水相體系同時(shí)提取菠蘿皮總黃酮和多糖，結(jié)果表明黃酮最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)95%，料液比1∶30（g/mL），磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，提取溫度50℃，超聲時(shí)間20 min。多糖最優(yōu)提取工藝為乙醇分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1∶45（g/mL），磷酸氫二鉀質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%，提取溫度為60℃。超聲時(shí)間20 min。在最優(yōu)工藝條件下經(jīng)過3次平行試驗(yàn)，提取3次，黃酮和多糖萃取率分別為88.64%、86.91%，得率分別為21.33、18.95 mg/g。說明工藝條件穩(wěn)定可行，結(jié)果重現(xiàn)性較好。

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