響應面法優(yōu)化白茅根總黃酮超聲輔助提取工藝

李西騰，張佳佳，尹嵐，鄭楠

（江蘇食品藥品職業(yè)技術學院食品學院，江蘇淮安223003）

白茅根為禾本科多年生草本植物白茅的根莖[1]，白茅根中含有三萜類化合物、苯丙素類化合物、有機酸類化合物、糖類、甾醇類、色原酮、黃酮類、內酯類，以及鐵、銅、鋅等礦物質，主要有止血、免疫調節(jié)、利尿降壓、抑菌、抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、降血糖、降血脂、降低羥自由基、抗氧化、改善腎功能等作用[2-7]。其中黃酮類化合物具有清除人體內自由基、改善血液循環(huán)、降低膽固醇等功效[8-10]。優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝，對其藥用開發(fā)與利用具有重要意義。目前，關于白茅根活性成分提取工藝的研究主要集中在多糖[11-13]、綠原酸[14-15]、總酚酸[16-18]、三萜類化合物等成分[18]，尚無利用響應面法優(yōu)化超聲提取白茅根總黃酮的工藝條件的研究報道。本研究選擇乙醇體積分數、液料比、超聲功率、提取時間等因素進行白茅根總黃酮提取工藝單因素試驗，以響應面試驗設計優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝，為其開發(fā)應用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白茅根：淮安市藥材市場；蘆丁標準品、乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉：國藥集團化學試劑有限公司。

YB-2500A型高速多功能粉碎機：浙江永康市速鋒工貿有限公司；SCIEENT型超聲波細胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平：日本島津公司；SHZ-DCⅢ循環(huán)水式真空泵：上海亞榮生化儀器廠；TU-1950紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白茅根總黃酮提取

將白茅根于60℃烘干后粉碎過60目篩。稱取樣品1.0 g，加入乙醇溶液，置于超聲波清洗機中提取，抽濾，濾液稀釋后搖勻，作為待測液。

1.2.2 白茅根總黃酮測定方法

采取硝酸鋁顯色法[19-20]測定總黃酮含量。在510 nm波長處測吸光度，繪制標準曲線，得回歸方程：

y=7.744 6x+0.005 6，R2=0.999 2。根據回歸方程，計算被測樣液中總黃酮的含量。

式中：c為樣品的吸光度代入回歸方程計算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為提取液定容量，mL；m 為樣品質量，g。

1.2.3 單因素試驗

以白茅根總黃酮提取量為指標，對影響白茅根總黃酮提取的各單因素進行研究。

乙醇體積分數：固定反應條件液料比25∶1（mL/g），超聲功率400 W，超聲處理30 min，考察不同乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量的影響。

液料比：固定反應條件乙醇50%，超聲功率400W，超聲處理30 min，考察不同液料比對白茅根總黃酮提取量的影響。

超聲功率：固定反應條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲處理30 min，考察不同超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響。

時間：固定反應條件液料比 25∶1（mL/g），乙醇50%，超聲功率400 W，考察不同處理時間對白茅根總黃酮提取量的影響。

1.2.4 響應面試驗設計

依據單因素試驗，選取乙醇體積分數、液料比、超聲功率和時間4個因素，黃酮提取量為響應值，通過Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化最佳提取工藝條件，具體設計如表1所示。

表1 響應面試驗設計Table 1 Design of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量的影響

不同乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量影響的結果如圖1所示。

圖1 乙醇體積分數對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖1可知，當乙醇體積分數逐漸增大時，白茅根總黃酮提取量呈現出先增加后減少的趨勢，當乙醇體積分數為50%時，提取到的總黃酮量較大，因此這里選擇50%的乙醇體積分數。

2.1.2 液料比對白茅根總黃酮提取量的影響

不同液料比對白茅根總黃酮提取量影響的結果如圖2所示。

圖2 液料比對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖2可知，當液料比逐漸增加時，提取到的白茅根總黃酮的量呈現出先增加后減少的趨勢，液料比25∶1（mL/g）時最多。由于增加液料比會稀釋溶液，使得黏度得以降低，這對超聲波的空化非常有利，因此能夠增加提取量，然而，若料液比進一步增加，溶液體積增加將會導致機械效應以及空化作用減弱。所以，這里選擇液料比 25 ∶1（mL/g）。

2.1.3 超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響

不同超聲功率對白茅根總黃酮提取量影響的結果見圖3。

圖3 超聲功率對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖3可知，當超聲功率逐漸升高時，提取到的白茅根總黃酮的量呈現出先增加后降低的趨勢，當超聲功率為500 W時，提取到的總黃酮的量較大，當超聲功率繼續(xù)增加時，總黃酮的提取量下降。因此，選擇超聲功率為500 W。

2.1.4 提取時間對白茅根總黃酮提取量的影響

不同提取時間對白茅根總黃酮提取量影響的結果見圖4。

圖4 提取時間對白茅根總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

由圖4可知，總黃酮的提取量隨著超聲時間的增加而增加，超過30 min降低。因此，選擇30 min為適宜的超聲時間。

2.2 響應面優(yōu)化試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果

響應面試驗結果如表2所示。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface

利用Design Expert 8.0.6軟件進行回歸分析，得到白茅根中總黃酮提取量（Y）對乙醇體積分數（A）、液料比（B）、超聲功率（C）和提取時間（D）的二次多項回歸方程為：Y=2.18-0.012A-0.056B+0.10C-0.058D-0.056AB-0.11AC+0.022AD-0.068BC-0.024BD-0.029CD-0.13A2-0.20B2-0.23C2-0.15D2。

2.2.2 回歸方程方差分析

方差分析結果見表3。

從表3可以看出模型Prob>F值小于0.000 1，表明該回歸方程極顯著，失擬項不顯著，模型的相關系數R2為0.982 3，說明模型方程擬合程度好，可以用于黃酮提取試驗的理論預測。

表3 回歸方程系數顯著性檢驗Table 3 Regression coefficients and their significance test

2.2.3 響應曲面分析及優(yōu)化

響應曲面圖見圖5。

圖5 各因素交互作用對白茅根總黃酮提取量影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on total flavonoids yield of Rhizoma imperatae

除了乙醇體積分數，液料比、超聲功率和提取時間對黃酮提取量的影響顯著。兩兩因素之間對響應值均有一定的交互作用，其中AB、AC、BC之間的交互作用比較明顯。由圖5可知，該試驗模型都能達到極值點，利用軟件進行分析，發(fā)現白茅根總黃酮的最佳提取工藝如下：乙醇體積分數 48.50%、液料比 24.22∶1（mL/g）、超聲功率529.47 W、提取時間28.93 min，此時的預測值為2.21 mg/g。為方便實際操作，采用乙醇體積分數50%，液料比 25∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時間30 min，在此優(yōu)化條件下進行3次平行試驗，結果為2.18 mg/g，將試驗值與預測值相近，說明該回歸模型與實際情況擬合較好。

3 結論

通過Box-Benhnken響應面優(yōu)化并得到了提取白茅根總黃酮的最佳工藝條件：乙醇體積分數50%，液料比 25 ∶1（mL/g），超聲功率 530 W，提取時間 30 min，實際提取到的白茅根總黃酮為2.18 mg/g，與理論預測值2.21 mg/g相近。說明采用響應面法優(yōu)化白茅根總黃酮提取工藝具有可行性。試驗發(fā)現超聲輔助可以提高總黃酮的提取效率，還需要進一步探討超聲對其生物活性影響的相關性，以及白茅根總黃酮的抗氧化活性。

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