辣木葉渣中非水溶性蛋白及酶解效果研究

施婭楠，和麗菊，趙存朝，黃艾祥

（云南農業大學食品科學技術學院，云南昆明650201）

辣木（Moringa oleifera Lam.）是一種多年生木本植物，原產于印度西北部，具有生長速度快、耐高溫、耐旱的特點[1-4]，辣木以其高蛋白質、低脂肪、高纖維素、維生素的健康特性和降血糖、抗菌消炎、強心的保健效果而成為健康食品界的新寵，2012年被中國綠色食品發展中心認定為“國家首推綠色食品”，如今在發展中國家廣泛種植[5-10]。辣木蛋白是一種優質蛋白，葉中蛋白含量在27%～37%，其中約80%谷蛋白，14%醇溶蛋白，3.5%白蛋白和1%球蛋白[11]，因此，約90%以上的葉蛋白為非水溶性的谷蛋白和醇溶蛋白，谷蛋白分子內存在巰基和分子之間的二硫鍵，結構決定其不溶于中性鹽溶液而只溶于稀酸、稀堿；醇溶蛋白疏水性較強，使得辣木蛋白在弱堿提、弱酸提或鹽溶后仍被保留在葉中[12]，因此，辣木蛋白溶解、乳化性能不佳等原因，多作為動物飼料使用，造成蛋白資源的極大浪費[13]。酶法可破壞蛋白質與其他非水溶性物質結合，且蛋白多肽鏈可水解為短肽鏈從而提高蛋白質溶解性，并對其他功能特性產生一定的作用[14-18]。本研究從蛋白資源開發和辣木葉資源的充分利用兩方面考慮，開展從辣木葉渣中提取非水溶蛋白，旨在能將蛋白充分提取并適當改性后，增強蛋白消化吸收性、以期加工成食用乳化劑、起泡劑、膠凝劑和多肽類產品。

1 材料與方法

1.1 材料

辣木葉粉：云南德宏州天佑科技開發有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、R-250、甘油、甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、TEMED、Tris-Hcl、溴酚藍（分析純）、果膠酶（500 U/mg）、木聚糖酶（6 000 U/mg）、復合植物水解酶（200 U/mg）、堿性蛋白酶（200 U/mg）：Sigma公司；鹽酸（食品級）：北京化工試劑廠。

1.2 儀器

UV765PC紫外分光光度計、DHG-9070A真空冷凍干燥機：上海精密科學儀器有限公司；RE-52AA旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器公司；TGL20M高速冷凍離心機：湖南湘立科學儀器有限公司；超聲波萃取儀：上海力申科學儀器有限公司；Bio-rad 164-5052電泳儀：BIO-RAD；I99161pH計：納沃德儀器（北京）有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋：海博訊實業有限公司；8-2磁力攪拌器：北京世紀陽光科技發展有限公司；XH微型漩渦混合器：上海躍進醫療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

辣木葉渣的制備為了最大可能地去除辣木葉水浸出物，去除水溶性蛋白質，采用0.08 mol/L堿液提取，料液比1∶80（g/mL）提取浸提2次，每次超聲時間30 min，測蛋白含量，葉渣55℃烘干保存；葉渣在最適酶解條件下4℃渦旋振蕩10 min，真空濃縮至原10倍體積，加入濃縮液4倍體積的75%預冷乙醇溶液，-4℃沉淀過夜，真空冷凍干燥得辣木蛋白干粉（-20℃保藏）。

1.3.2 單因素試驗

以辣木葉渣蛋白質的提取率為指標，研究水解酶種類、酶用量、酶解溫度、時間4個因素變量。設置酶種類為果膠酶、復合植物水解酶、木聚糖酶、堿性蛋白酶；酶用量 0.3%、0.8%、1.3%、1.8%、2.3%；酶解溫度 40、45、50、55、60 ℃；酶解時間 40、50、60、70、80 min。

1.3.3 響應面優化提取條件

在單因素試驗結果的基礎上，以酶的添加量、酶解時間、酶解溫度為試驗因素，進行響應面試驗，優化辣木葉渣蛋白提取率的工藝參數，響應面試驗設計及結果見表1。

表1 試驗因素水平Table 1 Level of experimental factors

1.3.4 蛋白質提取率

以標準蛋白質含量（μ/g）為橫坐標，吸光度為縱坐標，以牛血清白蛋白作標準蛋白，在波長595 nm處繪制標準曲線，標準曲線回歸方程如下：

式中：C為蛋白質質量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為提取液稀釋倍數；M為辣木葉渣質量，g。

1.3.5 SDS-PAGE凝膠電泳

1.3.5.1 制備樣品

分別取100 mg辣木葉蛋白質干粉樣品溶解在100 mL，100 mmol/L，pH6.5的磷酸緩沖溶液中，加入0.1%的NaN3，低溫加熱，漩渦振蕩3 min使之溶解，離心（8 000 r/min，2 min），備用。

1.3.5.2 配制5×電泳緩沖液、固定液、染色液、脫色液等電泳使用相關溶液

將配置好的樣品和上樣緩沖液混合，按樣品：載樣液=4∶1（體積比）的比例配制成1 mL的溶液后搖勻，沸水浴加熱10 min制得電泳樣，于4℃冰箱保存備用。

1.3.5.3 配膠

取綠色夾板固定薄厚玻璃板，支架固定好夾板，準備裝分離膠和濃縮膠（預試驗確定分離膠濃度為15%），制備分離膠時小心避免產生氣泡，迅速在膠上部加超純水，使凝膠表面變得平整，待膠凝固30 min，棄去水層用濾紙將多余的水吸干，灌注濃縮膠，直至凝膠溶液達到玻璃板的頂端，立即插入梳子，待膠凝固30min。

1.3.5.4 電泳

移液槍小心將蛋白marker、電泳樣依此加入到凹槽內，加入適量的5×電泳緩沖液，鏈接電源，設定濃縮膠電泳條件為50 V恒壓30 min，分離膠電泳條件為120 V恒壓約1 h，等溴酚藍跑至凝膠底部，關閉電源。

1.3.5.5 電泳膠片的處理

電泳結束，取下膠片，依次對電泳膠片進行固定、染色、脫色、掃描分析。

固定：電泳結束，將電泳膠片從夾板上取出，切去濃縮膠后，放入30%的乙醇溶液中固定30 min。染色：將固定好的膠片，轉移到考馬斯亮藍G-250染液中染色，放置于搖床上均勻染色，5 h。脫色：染色結束后，用20%的甲醇或超純水進行脫色，多次洗脫至條帶清晰可見。掃描：將脫色后的膠，放在掃描儀上掃描，放膠時注意避免產生氣泡。

2 結果與討論

2.1 提取工藝參數

2.1.1 酶種類對蛋白提取率的影響

不同水解酶對辣木殘渣蛋白提取的影響見圖1。

圖1 不同種類酶對殘渣蛋白提取率的影響Fig.1 The effect of enzyme species on the residual protein extraction rate

由圖1可知，不同水解酶對辣木葉渣蛋白質提取率的影響：堿性蛋白酶>木聚糖酶＞復合植物水解酶＞果膠酶，由于不同種類的水解酶的作用于蛋白質的機理和酶催化動力學特征不同導致提取效果有明顯不同。堿性蛋白酶的提取效果在所選4種酶制劑中最好，提取率達36.4（mg/g），辣木葉中多糖含量極高，堿性蛋白酶可使葉渣中多糖結構變得松散，對蛋白質和多糖的分離起到了促進作用[17]，同時堿性蛋白酶是一種內切肽酶，能夠水解多種蛋白，提取率相對較高，且售價合理。所以，本試驗采用堿性蛋白酶。

2.1.2 酶的添加量對蛋白提取率的影響

酶添加量對辣木殘渣蛋白提取的影響見圖2。

圖2可知，堿性蛋白酶用量1.8%（E/S）時，提取率達34.7（mg/g）。隨著酶用量的增加，提取率反而下降，這是因為蛋白質受到酶的過度水解，空間結構受到破壞，與考馬斯亮藍結合的疏水區減少，所以酶用量提高而蛋白提取率下降。同時，把已水解的蛋白質水解成更小的肽[20]，而蛋白質含量并沒有增加，提取率反而降低。

圖2 酶添加量對殘渣蛋白提取的影響Fig.2 The effect of enzyme dosage on the residual protein extraction rate

2.1.3 酶解溫度對蛋白提取率的影響

酶解溫度對辣木殘渣蛋白提取的影響見圖3。

圖3 酶解溫度對殘渣蛋白提取的影響Fig.3 The effect of enzyme hydrolysis temperature on the residual protein extraction rate

在堿性蛋白酶用量1.8%（E/S）的條件下提取蛋白質，該酶理論最適作用溫度為50℃～60℃，由圖3可知，本試驗最適作用溫度為55℃，溫度繼續升高時，酶活性降低，蛋白提取率降低，當溫度高于55℃，尤其是具有催化活性的四級結構發生變化，易變性，同時由于疏水基團的暴露和展開、蛋白質分子的聚集，使葉渣中的蛋白質溶解度下降，導致酶提時蛋白質提取率下降[12]。

2.1.4 酶解時間對蛋白提取率的影響

酶解時間對蛋白提取率的影響見圖4。

圖4 酶解時間對殘渣蛋白提取率的影響Fig.4 The effect of enzyme hydrolysis time on the residual protein extraction rate

在堿性蛋白酶用量1.8%（E/S），酶解溫度55℃的條件提取蛋白質，由圖4可知，提取的時間越長，提取率越高，在60 min～70 min內，增長速率很快；當時間達到70 min后，隨著時間的延長，蛋白質的提取率變化不大，且緩慢減低，蛋白酶催化植物蛋白質水解時是通過催化肽鍵的斷裂來發揮作用的，其作用于肽鏈內部的肽鍵，生成長度較短的多肽鏈，使得大分子蛋白的質量降低，得到小分子蛋白[16]。

2.2 響應面試驗

2.2.1 響應試驗設計及結果

進行響應面試驗，優化辣木蛋白的提取率參數，試驗設計及結果見表2。

表2 響應面分析方案及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 顯著性檢驗

利用Design-Expert8.0.6軟件對表2進行多元回歸擬合，得到辣木蛋白提取率對X1酶的添加量（%）、X2酶解時間（min）、X3酶解溫度（℃）的回歸模型方差分析表。模型的方差分析結果如表3所示。

利用Design-Expert 8.06軟件對表2試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到蛋白質提取率X1酶的添加量（%）、X2酶解時間（min）、X3酶解溫度（℃）的回歸模型方程為：蛋白提取率Y=36.63-0.35X1-0.53X2-1.08X3-0.20X1X2+0.12X1X3-0.35X2X3-4.22X12-1.87X22-3.68X32。

表3 方差分析結果Table 3 Variance analysis results

從方差分析可以看出，回歸模型F=174，97，P＜0.01，表明二次多元回歸模型顯著；失擬項F=0.78，P=0.560 3＞0.05，模型失擬不顯著，說明未知因素對結果的影響非常小，試驗誤差主要來源于隨機誤差。回歸診斷表明，決定系數R2=0.439 5，信噪比Adeq precisior=24.326。這表明方程的擬合和可信度高，可用于預測辣木中可溶性蛋白的提取。CV（Y變異系數）表示試驗本身的精度，CV值越小，試驗的可靠性越高，本試驗中CV比較低，為0.28%，表明試驗操作的可信度高，具有實用性指導意義。通過回歸系數的絕對值分析了每個因素對辣木蛋白提取變化的影響，檢驗可知：X22的影響顯著（P＜0.01），X12，X32的影響極顯著（P＜0.001）。據F值可知，各個因素對辣木蛋白的提取率影響的大小順序為：X3酶解溫度＞X1酶的添加量＞X2酶解時間。

2.2.3 響應面優化提取條件

X1酶的添加量（%）、X2酶解時間（min）、X3酶解溫度（℃）可以通過觀察圖5中的響應面的變化和輪廓線的稀疏度來衡量蛋白提取率的影響。當輪廓為圓形時，兩個因素之間的相互作用不顯著，而橢圓形或鞍形形狀顯示兩個因素之間的相互作用是顯著的。各因素交互作用對辣木蛋白提取影響的響應面圖見圖5。

圖5可以表明：交互項X1X2、X1X3、X2X3影響極顯著（P＜0.01）。而且 X1、X2、X3之間的相互作用的變化是陡峭的，表明每個因素對辣木提取率的影響大，與方差分析一致。其中等高線呈名的橢圓形和馬蹄形，說明這4個因數的相互作用是顯著的，對辣木蛋白的提取率影響較大。

圖5 各因素交互作用對辣木蛋白提取影響的響應面圖Fig.5 Response surface graph interactive effects of various factors on the protein extract of Moringa oleifera

2.2.4 最佳條件的確定和回歸模型的驗證

通過響應面法得到辣木葉渣中蛋白的最佳提取工藝為堿性蛋白酶添加量1.4%，酶解溫度為54.5℃，酶解時間為68.4 min，此條件提取率為（35.88±1.73）mg/g。實際操作中稍作調整確定的最佳工藝條件為堿性蛋白酶添加量1.8%，酶解溫度為55℃，酶解時間為70 min，在此條件下進行驗證試驗，得到的蛋白提取率為（34.92±1.42）mg/g與理論值接近，說明模型與實際相符，具有實際應用的價值。

2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

辣木葉總蛋白質在非還原條件下的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜見圖6，酶解后蛋白電泳圖譜見圖7。

圖6 總蛋白的電泳圖Fig.6 Electrophoresis profiles of total proteins

酶解前在高分子區域有25 KD～100 KD蛋白譜帶，其中55 KD～100 KD屬于高分子量醇溶蛋白，75%預冷乙醇條件下部分醇溶蛋白被提取出來[22-23]。25 KD～55 KD譜帶為低分子量谷蛋白，其中25 KD～30 KD，55 KD為主要辣木葉谷蛋白，0.08 mol/L堿液可以將此部分蛋白提取出來，圖6區域顯示的蛋白可能是通過分子間二硫鍵交鏈形成的，使得這部分蛋白質在水或0.15 M氯化鈉提取過程中不能溶出[22-23]。

酶解條件下的凝膠電泳條帶見圖7。

圖7 酶解后蛋白電泳圖譜Fig.7 Electrophoresis profiles of the protein after enzymatic hydrolysis

通過添加量為1.8%的堿性蛋白酶，辣木葉中非水溶性蛋白在酶解過程中發生降解，形成分子在15 KD以下的小分子蛋白，其原因是，酶法可破壞蛋白質與其他非水溶性物質結合，且蛋白多肽鏈可水解為短肽鏈從而提高蛋白質溶解性，并且降解成為原先不存在的小分子蛋白。

3 結論

響應面分析法建立辣木葉渣中非水溶性蛋白提取的二次回歸模型，建立的最佳參數為堿性蛋白酶添加量1.8%，酶解溫度為55℃，酶解時間70 min，提取率為（34.92±1.42）mg/g。電泳結果顯示疏水作用、二硫鍵連同其它形式的共價鍵共同作用，使蛋白質發生聚集導致溶解性降低，酶解后蛋白質高分子量亞基的谷蛋白和醇溶蛋白基本消失，在低分子區域形成15 KD以下的蛋白譜帶。

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