高效液相色譜法測定飲料中B族維生素

忻欣，高飛，韓瑩，張宏偉，何悅

（1.西派特（北京）科技有限公司，北京100029；2.北京邁迪安生物科技有限公司，北京100022；3.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；4.北京檢驗檢疫檢測中心，北京100026）

B族維生素是很多重要酶的輔酶，缺乏將會導致與之相關的某些疾病的發生[1-2]，具最近研究報道，B族維生素具有一定的改善沮喪情緒的作用[3]，提高身體機能[4]的功能以及對糖尿病人的大腦的保護作用[5]。B族維生素人體無法自身合成，必須從食物中攝取[6]。我國食品安全國家標準中B族維生素的檢測方法為單獨一種維生素單獨測定，無法進行多種B族維生素同時檢測。如VB1采用高效液相色譜串聯熒光檢測器（High Performance Liquid Chromatography-Fluorescence Detector，HPLC-FLD）的方法或者熒光分光光度計方法[7]，VB2采用HPLC-FLD或者熒光分光光度計方法[8]，VB6采用HPLC-FLD或者微生物方法[9]，VB12采用微生物方法或者高效液相色譜串聯紫外檢測器（High Performance Liquid Chromatography-UV Detector，HPLC-UV）方法[10-11]，煙酰胺采用微生物方法或者HPLC-UV方法[12]等等，由于食品安全國家標準的方法無法同時測定多種B族維生素，不太適合用于日常產品品質監控。多種B族維生素同時檢測也逐漸成為研究熱點，具文獻報道，研究者常使用HPLC-UV/FLD法[13-15]，HPLC-化學發光法[16]和HPLC-MS法[17]等。超高效液相色譜-串聯質譜法高效快速，但檢測成本高，高效液相色譜法對B族維生素可進行定性和定量分析，具有相對快速、分析靈敏度較高和回收率高等優點，成為最常用的檢測方法。本研究建立一種簡便、快速、準確和靈敏的測定飲料中B族維生素的HPLC-UV方法，可在20 min內一次性分析5種B族維生素。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀-紫外檢測器：美國安捷倫公司；ML204電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；（煙酰胺），（鹽酸吡哆醇）和VB12標準品：美國Sigma公司；色譜純甲醇、乙腈：德國默克公司；18 MΩ水由Milli-Q純水儀制。

1.2 溶液的配制

標準儲備溶液的配制：稱取適量的維生素標準品，用水配制成100 μg/mL的標準儲備溶液，于4℃冰箱內保存備用。

1.3 液相色譜分析條件

色譜柱：PhenomenexODS3C18柱（4.6mm×250mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動相：A超純水，B乙腈，C甲醇，洗脫梯度條件為：0 min～9 min，94%A，3%B，3%C；9 min～20 min，90%～80%A，10%～20%B；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長為 266 nm；進樣量：5 μL。

1.4 樣品前處理

取2 mL左右飲料樣品，經0.22 μm水系濾膜過濾，收集濾液直接上樣。如樣品較為粘稠或維生素含量偏大可以使用超純水進行稀釋后經0.22 μm水系濾膜過濾，收集濾液直接上樣，含氣飲料事先進行30 min超聲脫氣。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的優化

使用紫外分光光度計對標準樣品進行190 nm～400 nm波長掃描，VB1最大吸收波長為263 nm，VB2最大吸收波長為266 nm，煙酰胺最大吸收波長為262 nm，VB6最大吸收波長為291nm，VB12最大吸收波長為278nm，由于煙酰胺和VB6的出峰時間相近，因此無法進行波長調整，最終選擇266 nm作為檢測波長。

2.2 流動相體系的選擇

本研究對參考前人研究進行一系列流動相體系的選擇，通過調整流動相pH值、調整梯度范圍和調整有機溶劑的成分最終確定最佳的梯度洗脫程序。

磷酸二氫鉀和乙腈水溶液體系：對該體系進行梯度洗脫條件、pH值3～6和磷酸二氫鉀濃度[18-19]調整。試驗結果表明，無論原始參考文獻方法還是改進方法均容易出現出峰時間和基線不穩定，檢測時間較長時容易導致基線不穩，尤其是在進行梯度洗脫的時候基線波動過大，導致定量困難，而且分析時間長達35 min，因此淘汰此體系。

甲醇和水溶液體系：對甲醇水溶液體系進行梯度洗脫條件和pH值3～6調整。試驗結果表明，該體系無法全部分離出5種B族維生素，且出現3個饅頭峰，因此淘汰此體系。

乙腈和水溶液體系：對乙腈水溶液體系進行梯度洗脫條件和pH值3～6調整。試驗結果表明，5%乙腈濃度，可以將各個成分分開，VB2和VB12分離時間過長；梯度洗脫條件下，在0 min～10 min，5%乙腈水溶液，10 min～20 min，5%～30%的梯度洗脫條件下，VB2和 VB12在較短的時間內進行了分離，但是VB6的峰形較差；使用乙酸調整水的 pH 值至 3、4、5 和 6，在 0～10 min，5%乙腈水溶液，10 min～20 min 5%～30%的梯度洗脫條件下，煙酰胺的峰形很差，出現前拖尾峰。該體系無法用于定量，因此淘汰此體系。

甲醇、乙腈和水溶液體系：對甲醇、乙腈和水溶液體系進行梯度洗脫條件調整。試驗結果表明，在0～10 min使用3%乙腈、3%甲醇和水溶液體系進行洗脫，在10 min～20 min使用乙腈3%～30%進行梯度洗脫，試驗結果表明各個組分均得以分開，峰形對稱。因此選用該體系進行下一步的試驗。

2.3 標準品色譜圖

根據1.3的色譜條件和1.4的方法進行操作，得出標準品和樣品的色譜圖見圖1，色譜圖橫坐標為分離時間（min），縱坐標為266 nm檢測波長下紫外吸光度（mAu）。由圖1可知，所得5種B族維生素色譜峰形對稱，基線平穩，且樣品中的5種B族維生素和雜質的分離度好。

2.4 標準曲線及回歸方程

將B族維生素的標準品分別稀釋制成濃度為1.0、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0 μg/mL 的標準溶液。根據相應的峰面積和對應的檢測濃度制作標準曲線（見表1），此標準曲線的相關系數為R2=0.997 5～0.999 4。

圖1 混合標準品（a）和飲料樣品（b）色譜圖Fig.1 Chromatograms of vitamin B standard mixture（a）and drinks（b）

表1 B族維生素標準曲線Table 1 The standard curves of B vitamins

2.5 檢測限

將各種B族維生素標準品制成一系列不同濃度的標準品溶液，以信噪比S/N=3時的質量濃度作為檢出限，得到VB1最低檢測濃度為1 μg/mL，VB2最低檢測濃度為 0.1 μg/mL，煙酰胺最低檢測濃度為 1 μg/mL，VB6最低檢測濃度為 1 μg/mL，VB12最低檢測濃度為 0.1 μg/mL。

2.6 精密度和回收率

分別取 1、10 μg/mL 和 20 μg/mL 的各個 B 族維生素標準品溶液，連續進樣3次，每次進樣5 μL，根據峰面積計算其相對標準偏差（RSD），結果見表2。

表2 精密度試驗結果（n=3）Table 2 Results of precision assay（n=3）

由表2可知，各個樣品測定結果的重現性較好，平均回收率95.75%～102.07%，RSD均小于3%，該色譜分析方法對于B族維生素的分析是準確、可信。

3 結論

本文建立一種高效液相色譜-紫外法測定飲料中5種B族維生素的檢測方法，采用直接或者稀釋后0.22 μm濾膜過濾直接上樣，使用Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，采用水、乙腈、甲醇三相梯度洗脫，紫外檢測波長為266 nm。試驗結果表明，本方法前處理簡單，靈敏度和準確度高，可以滿足對飲料產品中（煙酰胺），（鹽酸吡哆醇）和5種B族維生素快速檢測要求。

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