草木犀藥材的生藥學(xué)研究Δ

朱忠華，任德全，馮利，羅超（.長(zhǎng)江職業(yè)學(xué)院生物醫(yī)藥學(xué)院，武漢430064；2.湖北技能型人才培養(yǎng)研究中心，武漢 430074）

草木犀Melilotus officinalis（Linn.）Pall.在我國(guó)絕大部分地區(qū)都有分布，屬于豆科蝶形花亞科車(chē)軸草族草木犀屬的植物[1-3]，草木犀別名辟汗草、黃香草木犀，有一年生也有二年生的草木犀，夏、秋季采收地上部分藥用。其味微甘，性平，歸脾、大腸經(jīng)，有止咳平喘、散結(jié)止痛之功效，主治哮喘、支氣管炎、腸絞痛、創(chuàng)傷、淋巴結(jié)腫痛[4-5]。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，草木犀具有抗炎抗菌，促進(jìn)損傷性骨折愈合，改善血液循環(huán)，抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用[5]。有關(guān)草木犀藥材化學(xué)成分和藥理研究的文獻(xiàn)報(bào)道頗多[6-10]，但尚未見(jiàn)其組織切片相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)首次報(bào)道了草木犀藥材的組織結(jié)構(gòu)特征、藥材樣品提取物紫外光譜和藥材樣品粉末紅外光譜及二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖，可為草木犀藥材的生藥學(xué)鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

UB100i型生物顯微鏡、ZSA0745型體視顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）；UV-1800型紫外分光光度儀（上海美析儀器有限公司）；FTIR-650型紅外分光光度儀（天津港東科技發(fā)展有限公司）。

1.2 試劑

乙醇、石油醚、水合氯醛均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

試驗(yàn)所用藥材分別采集于湖北省和江西省不同地區(qū)（見(jiàn)表1），經(jīng)筆者鑒定為真品（CJ-10為對(duì)照藥材）。植物標(biāo)本保存于長(zhǎng)江職業(yè)學(xué)院中藥制劑分析實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 形態(tài)與性狀鑒定

原植物為一年生草本，植株高達(dá)100 cm。莖直立，多分枝，具縱棱，微被柔毛。羽狀三出復(fù)葉，托葉為鐮刀狀，長(zhǎng)約5 mm；葉柄細(xì)長(zhǎng)；小葉倒闊卵形、卵形、倒披針形，長(zhǎng)約3 cm，寬約10 cm，先端鈍圓或截形，基部闊楔形，邊緣具不整齊疏淺齒，葉上表面光滑，下表面有短柔毛，三處復(fù)葉的頂生小葉具較長(zhǎng)小葉柄，側(cè)小葉的小葉柄短。花黃色，總狀花序腋生，長(zhǎng)約20 cm。植物根上分布有多數(shù)的根瘤。原植物形態(tài)見(jiàn)圖1。

表1 草木犀藥材來(lái)源Tab 1 Origin of M.officinalis

圖1 原植物形態(tài)圖Fig 1 Figure of plant morphology

2.2 顯微鑒別

2.2.1 藥材樣品根橫切面 藥材樣品根橫切面為類(lèi)圓形，其最外層木栓層，大約由12層細(xì)胞構(gòu)成。緊挨木栓層的是栓內(nèi)層，在栓內(nèi)層中有大量的纖維束及散在的單個(gè)纖維分布，大約由17層細(xì)胞構(gòu)成，維管束呈輻射型；木質(zhì)部呈19束放射狀排列，占整個(gè)橫切面積的3/5；木質(zhì)部與髓射線相間排列，木質(zhì)部中髓射線寬2～6列細(xì)胞，形成層明顯；韌皮部在木質(zhì)部外圍，由8層左右細(xì)胞組成；周皮占整個(gè)橫切面積的2/5。根橫切面見(jiàn)圖2。

2.2.2 藥材樣品莖橫切面 藥材樣品莖橫切面邊緣略呈輕度波浪狀彎曲的五邊形。表皮為1層長(zhǎng)方形細(xì)胞，外被角質(zhì)層，稀有非腺毛分布。皮層由6層左右薄壁細(xì)胞組成，細(xì)胞之間有間隙；有16個(gè)大小不等的維管束排列成環(huán)狀，維管束為輻射型，形成層環(huán)明顯，導(dǎo)管呈規(guī)則的放射狀排列。中心為寬廣的髓部，由大型薄壁細(xì)胞組成，占整個(gè)橫切面積的4/5。莖橫切面見(jiàn)圖3。

2.2.3 藥材樣品小葉片橫切面 藥材樣品橫切面上下表皮均為1列細(xì)胞，被角質(zhì)層；葉上部為柵欄組織，下部為海綿組織，柵欄組織比海綿組織稍寬；主脈維管束1束，導(dǎo)管呈規(guī)則的放射狀排列，主脈維管束正上方有柵欄組織通過(guò)。小葉片橫切面見(jiàn)圖4。

圖2 根橫切面圖Fig 2 Figure of radix cross section

圖3 莖橫切面圖（10×）Fig 3 Figure of stem cross section（10×）

圖4 小葉片橫切面圖（10×）Fig 4 Figure of leaf cross section（10×）

2.2.4 藥材樣品葉柄橫切面 藥材樣品葉柄橫切面呈心形，上、下最外兩層為表皮細(xì)胞，表皮外附有角質(zhì)層，在橫切面周?chē)植加形逄幒窠墙M織，薄壁組織中有3個(gè)大小不等的維管束成三角形排列。維管束為外韌型，其中導(dǎo)管呈規(guī)則的放射狀排列。葉柄橫切面見(jiàn)圖5。

圖5 葉柄橫切面圖（10×）Fig 5 Figure of leafstalk cross section（10×）

2.2.5 藥材樣品葉和葉柄表皮（撕裂法）顯微觀察 藥材樣品葉下表皮細(xì)胞為一層凹凸齒輪狀的不規(guī)則形；葉上表皮細(xì)胞為輕度波狀彎曲的不規(guī)則形；葉柄表皮細(xì)胞呈多邊形，大小不等，排列緊密，細(xì)胞壁較薄。在葉上表皮及葉柄表皮中都有氣孔分布，不定式，長(zhǎng)橢圓形；葉下表皮中氣孔指數(shù)為33%，小葉上表皮中氣孔指數(shù)為23%，葉柄表皮中的氣孔指數(shù)為6%。葉下表面及葉柄上的表皮細(xì)胞外有豐富的非腺毛分布；葉柄表皮上還有腺毛分布，非腺毛為單細(xì)胞，非腺毛表面上可見(jiàn)疣狀突起，非腺毛是腺毛長(zhǎng)度的3～5倍。葉和葉柄表皮顯微圖見(jiàn)圖6。

圖6 葉和葉柄表皮顯微圖（10×）Fig 6 Microstructure of leaf and leafstalk epidermis（10×）

2.2.6 藥材樣品組織解離觀察 藥材樣品粉末暗綠色，葉片下表皮細(xì)胞為凹凸齒輪狀的不規(guī)則形；葉片上表皮細(xì)胞輕度彎曲，上、下表皮有氣孔分布，不定式排列，氣孔有3個(gè)或4個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞。葉柄表皮細(xì)胞呈多邊形，表皮有氣孔分布，不定式排列，氣孔有3個(gè)或4個(gè)副衛(wèi)細(xì)胞；在葉柄下部表皮還有腺毛及非腺毛分布，非腺毛為單細(xì)胞，非腺毛表面有疣狀突起，腺毛的腺柄為2個(gè)細(xì)胞組成，腺頭為單細(xì)胞。絕大多數(shù)花粉粒為卵形，極少數(shù)為三角弧形，外壁光滑，3個(gè)萌發(fā)孔，其中1個(gè)萌發(fā)孔清晰可見(jiàn)；在葉中纖維上可見(jiàn)草酸鈣方晶排列，莖及根中未觀察到草酸鈣方晶；導(dǎo)管為螺紋。組織解離顯微圖見(jiàn)圖7。

圖7 組織解離顯微圖（10×）Fig 7 Microstructure of tissue dissociation（10×）

2.3 紫外光譜鑒別

2.3.1 檢測(cè)條件 波段：190～700 nm；吸收量程：0～3 A；狹縫：1 nm；掃描速度：200 nm/min；尺度擴(kuò)張：20 nm/cm。

2.3.2 供試品溶液的制備 分別取藥材樣品（編號(hào)：CJ1-9）粗粉（20～40目）2 g，置于50 mL碘量瓶中，分別加石油醚（60～90℃）及無(wú)水乙醇、水各20 mL[11]，室溫浸泡4 h，振搖，濾過(guò)，取續(xù)濾液，得藥材樣品石油醚、乙醇、水浸提物。

2.3.3 方法學(xué)考察 按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中供試品吸光度的RSD均＜2.0%，表明方法精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性較好。

2.3.4 藥材樣品檢測(cè) 取10批藥材樣品各適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.3.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄吸光度。結(jié)果，藥材樣品λHm2aOx為216.4、267.0、311.6 nm（肩峰）；λEmtOaxH為218.2、272.0、310.2、434.6、467.8、663.4 nm；λmpeatx為222.8、271.4、281.8 nm（尖峰），312.0、445.6 nm（弱寬峰），664.2 nm（弱峰）。紫外光譜見(jiàn)圖8。

2.4 紅外光譜鑒別

2.4.1 檢測(cè)條件 波段：400～4 000 cm－1；分辨率：4 cm－1；透過(guò)率：0～100%；掃描次數(shù)：32次。

2.4.2 供試品的制備 分別取藥材樣品（編號(hào)：CJ-9）粗粉（160目）2 g，溴化鉀壓片，即得。

2.4.3 方法學(xué)考察 按相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中供試品吸光度的RSD均＜2.0%，表明方法精密度、溶液穩(wěn)定性、方法重復(fù)性較好。

2.4.4 藥材樣品檢測(cè) 取10批藥材樣品各適量，分別按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備供試品，再按“2.4.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄吸光度。結(jié)果，供試品在3 415 cm－1處有強(qiáng)而寬的吸收峰，即為—OH的伸縮振動(dòng)峰，推測(cè)含有香豆素類(lèi)、酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)苷類(lèi)物質(zhì)；2 917 cm－1、2 846 cm－1處有吸收峰，即為—CH2的伸縮振動(dòng)峰；1 637 cm－1處有吸收峰，即為C＝O、C＝C、芳環(huán)的伸縮振動(dòng)峰；1 415 cm－1處有吸收峰，即為C-H的彎曲振動(dòng)；1 240 cm－1處有吸收峰，即為C—O—C的伸縮振動(dòng)峰，推測(cè)為苷和黃酮類(lèi)物質(zhì)；1 045 cm－1處有寬吸收峰，即為C-O的伸縮振動(dòng)峰；770～400 cm－1處有寬吸收峰，即為C-H的彎曲振動(dòng)峰。紅外光譜見(jiàn)圖9。

圖8 紫外光譜圖Fig 8 UV spectrum

圖9 紅外光譜圖Fig 9 IR spectrum

在1 800～800 cm－1波段區(qū)域使用二階導(dǎo)數(shù)光譜對(duì)圖9進(jìn)行分析。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜中1 637、1 415、1 240、1 045、600 cm－1處重疊所致的寬峰都被分解為若干個(gè)單峰，譜圖的分辨率得到極大提高。二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜見(jiàn)圖10。

圖10 二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig 10 Two order derivative IR spectrum

3 討論

試驗(yàn)中，藥材樣品原植物形態(tài)和性狀特征明顯，顯微特征突出。值得商議的是，《歐洲藥典》（第8版）草木犀藥材葉肉組織中偶有草酸鈣簇晶，但筆者多次研究，均未觀察到該結(jié)構(gòu)。

試驗(yàn)中，藥材樣品水浸提物應(yīng)在6 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，否則紫外光譜變化較大；而乙醇、石油醚浸提物放置時(shí)間對(duì)最大吸收峰位置無(wú)影響，但對(duì)各峰間的強(qiáng)度比有影響，筆者認(rèn)為可能是由于隨著藥材樣品浸泡時(shí)間變化，其各浸出成分的含量比不同所致。結(jié)果表明，紫外光譜中藥材樣品3種不同溶劑提取物在200～350 nm都有3個(gè)最大吸收峰，且最大吸收峰的位置基本一致。

在紅外光譜上化合物特征并不明顯，因此筆者以二階導(dǎo)數(shù)對(duì)其進(jìn)行處理，使圖譜分辨率提高，具有指紋圖譜性質(zhì)，在藥材樣品鑒定中具有較大的參考價(jià)值。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于草木犀藥材的生藥學(xué)鑒別。

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