NIRS結合PLS算法快速測定西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的總含量Δ

左春芳，梁雪琪，喻俊峰，呂亞新，張賢良（.解放軍第50中心醫院藥劑科，河南洛陽470；.洛陽理工學院附屬中學，河南洛陽 470；.解放軍第7660部隊，河南三門峽 47400）

西洋參Panax quinquefolius又稱洋參、花旗參，為五加科植物西洋參的干燥根，具有補氣養陰、清熱生津的功效[1-3]。西洋參藥材的主要活性物質為人參皂苷，現已分離出的皂苷按其母體結構分為4種類型：20（S）原人參二醇型、20（S）原人參三醇型、齊墩果烷型和奧克梯隆型，其中人參皂苷Rb1、Re屬于20（S）原人參二醇型，人參皂苷Rg1屬于20（S）原人參三醇型[4-6]。西洋參藥材由于受地域、環境、氣候等諸多因素的影響，品種繁多復雜，品質良莠不齊，因此通過測定西洋參藥材中有效成分人參皂苷的含量來控制西洋參藥材的質量是很有必要的。

2015年版《中國藥典》（一部）規定的西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的測定方法為高效液相色譜法（HPLC），該方法雖然準確度高，但飲片的前期處理非常煩瑣，測定過程耗時較長[7]。近紅外漫反射光譜技術（NIRS）是一種新興的分析技術，具有操作費用低、樣品前處理簡單、測定速度快等優點[8-9]。因此，本試驗采用NIRS結合偏最小二乘法（PLS）對西洋參飲片中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1的總含量進行定量測定，以達到快速檢測西洋參飲片優劣的目的。

1 材料

1.1 儀器

Nicolet 6700型NIRS儀（美國Thermo Nicolet公司）；20A型HPLC儀，包括SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本Shimadzu公司）；XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；RT-01型粉碎機（浙江溫嶺市大海藥材器械廠）；DK-S14型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司）。

1.2 試劑

人參皂苷Rg1對照品（批號：110703-201128，純度93.4%）、人參皂苷Re對照品（批號：110754-201324，純度：92.7%）、人參皂苷Rb1對照品（批號：110704-201223，純度：95.9%）均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 飲片

62份西洋參飲片購自洛陽不同藥店（見表1，表中未標明國家的地區即為中國），經解放軍第150中心醫院主任藥師梁延春鑒定為真品。

表1 西洋參飲片來源Tab 1 Resource of P.quinquefolius crude slices

2 方法與結果

2.1 人參皂苷含量（參考值）測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜柱：Intertsustain C18；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：203 nm；柱溫：40℃；進樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數以人參皂苷Rb1峰計＞5 000；各成分基線分離良好，分離度＞1.5，色譜見圖1。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution procedure

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱定待測成分各適量，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，制成人參皂Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1質量濃度分別為0.094、0.388、0.968 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取飲片樣品粉末適量，精密稱定，約1 g，置于錐形瓶中，加水飽和正丁醇50 mL，稱定質量，水浴加熱回流提取1.5 h，放冷，再次稱定質量，減失的質量用水飽和正丁醇補足，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，置于蒸發皿中，蒸干，殘渣加50%甲醇溶液溶解，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇溶液定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得[8]。

2.1.4 方法學考察 按相關標準進行方法學試驗，結果，精密度、穩定性、重復性試驗中人參皂Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1峰面積的RSD均＜3.0%，表明儀器精密度、溶液穩定性、方法重復性較好。

2.1.5 飲片樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的測定 取62批飲片樣品各適量，分別按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表3。

2.2 NIRS定量校正模型建立與驗證

2.2.1 NIRS的采集 取飲片樣品粉末（過4號篩）約5 g，置于石英樣品杯中，混合均勻，輕輕攤平，以空氣為參比，扣除背景采集NIRS。采集條件：采樣方式為積分球漫反射，分辨率為8 cm－1，采集波段為12 000～4 000 cm－1，掃描32次，溫度為（25±2）℃，相對濕度為45%～55%，重復操作3次。62份飲片樣品的近紅外原始光譜疊加圖見圖2。

2.2.2 校正集和驗證集樣品的選擇 將表3中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量分布情況輸入TQ Analyst 8.0分析軟件中，再隨機選取48份樣本作為校正集，14份樣本作為驗證集，且驗證集含量范圍處于校正集含量范圍之內，詳見表4。

2.2.3 光譜預處理方法的選擇 以多元散射校正（MSC）、標準歸一化法（SNV）、一階導數法（FD）、二階導數法（SD）等方法預處理光譜得不同校正集相關系數（R2）、校正均方差（RMSECV），詳見表5。

表3 飲片樣品中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的測定結果（n＝3，%）Tab 3 Results of content determination of ginsenoside Rg1，Re，Rb1in samples（n＝3，%）

圖2 62批飲片樣品的近紅外漫反射原始光譜疊加圖Fig 2 NIRS superposed spectrum of 62 batches of samples

表4 校正集與驗證集樣品指標成分含量分布范圍Tab 4 Distribution of target component contents of correction set and validation set

表5 不同預處理方法對定量模型性能的影響Tab 5 Effects of different pretreatment methods onthe performance of quantitative model

3 討論

運用TQ Analyst 8.0分析軟件對表5數據進行處理，結合偏最小二乘法（PLS）建立NIRS定量模型。選擇R2、RMSECV為評價指標，綜合評價不同模型的準確性與適用性。其中，RMSECV越小，代表模型的預測精度越高，R2越接近1，代表模型的預測準確性越高。結果表明，以SNV+FD預處理后，人參皂苷Rg1、Re、Rb1總定量模型效果最好，可以消除多重光譜偏差，對導數光譜進行微調處理，最佳光譜預處理方法處理后得到NIRS，詳見圖3。

圖3 預處理后的近紅外漫反射光譜圖Fig 3 Pretreated NIRS spectrum

2.2.4 模型波段的選擇 分別采用SNV+FD對不同的波段進行手動優化比較，通過TQ Analyst 8.0分析軟件得人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量最佳波段為7 664.23～5 236.05 cm－1，詳見表6。

表6 不同波段對R2和RMSECV的影響Tab 6 Effects of different spectral ranges on R2and RMSECV

2.2.5 主成分數的選擇 采用內部交叉驗證法篩選主成分數，選擇RMSECV值最小時對應的主成分數為最佳主成分數。結果表明，當人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的RMSECV值（0.010 26）最小時，主成分數為7，詳見圖4。

圖4 主成分數對RMSECV的影響Fig 4 Effects of principal component fraction on RMSECV

2.2.6 定量模型的建立 運用TQ Analyst 8.0分析軟件，以SNV+FD對光譜預處理，波段為7 664.23～5 236.05 cm－1，主成分數為7，結合PLS法建立人參皂苷Rg1、Re、Rb1總定量模型。定量模型預測值與參考值的相關性、偏差見圖5、圖6。結果表明，校正集樣品的結果均勻地分布在回歸線的兩側，校正集的預測值與參考值結果接近，證明該模型建立成功。

圖5 定量模型預測值與參考值的相關性Fig 5 Correlation between prediction value and reference value of quantitative model

圖6 定量模型預測值與參考值的偏差Fig 6 Deviations between predicted and reference values of a quantitative model

2.2.7 定量模型的驗證 將14批驗證集樣品的NIRS輸入定量模型中，將測得的NIRS預測值與參考值進行比較，結果見表7。

表7 預測值與參考值比較結果Tab 7 Compare the predicted values with the reference values

NIRS作為一種間接測定方法，首先要建立準確、可靠的模型，建立該模型的前提是要收集足夠多的有代表性的樣品。本試驗收集了62批西洋參飲片，通過驗證該模型表明可用于所收集的西洋參飲片中人參皂苷含量的測定，但是為了進一步提高模型的覆蓋范圍，下一步應盡量收集更多的西洋參飲片，完善所建模型。

本試驗僅對西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量建立了NIRS定量模型，為了更好地控制飲片質量，在以后的工作中需對水分、浸出物、總灰分等檢查項分別建立定量模型。

建立NIRS定量模型的過程是非常煩瑣的，為了建立一個穩定的數學模型，必須對所建模型進行評價，本試驗以R2、RMSECV為指標評價其精密度和準確度，結果可信。

綜上所述，本方法快速準確，簡便無污染，可用于西洋參飲片中人參皂苷Rg1、Re、Rb1總含量的快速測定。

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