HPLC法測定鹽酸氯卡色林原料藥中的有關物質

2018-01-18 09:22:35陶俊鈺劉為中劉偉何廣衛周潔合肥市食品藥品檢驗中心合肥38000合肥醫工醫藥有限公司合肥30601

中國藥房 2017年36期

陶俊鈺，劉為中，劉偉，何廣衛，周潔（1.合肥市食品藥品檢驗中心，合肥38000；.合肥醫工醫藥有限公司，合肥 30601）

鹽酸氯卡色林（Lorcaserin hydrochloride，Lorcaserin HCl），化學名為（R）-8-氯-1-甲基-2，3，4，5-四氫-1H-3-苯并氮雜卓鹽酸鹽半水合物[1-2]，是由Arena制藥公司研究開發，作用于中樞神經系統的新型減肥藥[3-5]。FDA于2012年6月27日批準其上市。該藥可有效避免傳統減肥藥激動5-HT2B受體引起的心臟瓣膜病變及肺動脈高壓，為臨床治療肥胖癥提供了新的選擇[6-9]。

目前，已有文獻對鹽酸氯卡色林合成的工藝路線進行了報道[10]，而對其原料藥的相關質量研究并未見報道。鹽酸氯卡色林以N-（4-氯苯基乙基）-2-丙烯-1-胺鹽酸鹽為起始原料，在三氯化鋁催化下進行分子內環合、拆分、成鹽酸鹽后進行水合物的制備而得。鑒于此，筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定鹽酸氯卡色林原料藥中有關物質的方法，以期為完善該原料藥的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-15C型HPLC儀，包括SPD-M20A型紫外檢測器、LC solution Lite色譜工作站（日本Shimadzu公司）；XS105型十萬分之一分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；FE20型pH計（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q Advantage A10型超純水機（上海摩勒科學儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸氯卡色林原料藥（合肥醫工醫藥有限公司，批號：20140901、20140902、20140903）；雜質1對照品（合肥伊博尼思化學技術有限公司，批號：20140810，純度：97%）；雜質2對照品（合肥醫工醫藥有限公司，批號：20140819，純度：98.9%）；雜質3對照品（合肥醫工醫藥有限公司，批號：20140829，純度：98.7%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch ultimate XB-ODS（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉二水合物5.6 g，加水1 000 mL使溶解，再加三乙胺調pH為6.5，A）-乙腈（B）（梯度洗脫程序見表1）[11-13]；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution procedure

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液分別稱取雜質1對照品18.90 mg、雜質2對照品20.35 mg、雜質3對照品24.81 mg，分別置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，即得單一對照品貯備液。取上述單一對照品貯備液各1 mL，置于同一50 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得雜質1質量濃度為15.12 μg/mL、雜質2質量濃度為16.28 μg/mL、雜質3質量濃度為19.85 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液精密稱取樣品50.12 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.3 空白對照溶液取流動相作為空白對照溶液。

2.2.4 系統適用性溶液精密稱取樣品50.34 mg，置于100 mL量瓶中，精密加入“2.2.1”項下單一對照品貯備液各2 mL，加流動相溶解并定容，搖勻，即得。

2.3 系統適用性試驗

精密量取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液和系統適用性溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，各雜質峰之間、主成分峰與雜質峰之間均能達到基線分離，分離度均＞1.5；且保留時間適宜；其他成分對測定無干擾。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 破壞性試驗

2.4.1 光照破壞樣品溶液取樣品10 mg，置于20 mL量瓶中加流動相溶解并稀釋至刻度，置于4 500 lx紫外燈下照射24 h，即得。

2.4.2 高溫破壞樣品溶液取置于150℃烘箱中放置8 h后的樣品10 mg，置于20 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，即得。

2.4.3 酸破壞樣品溶液取樣品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，取上述溶液5 mL，加1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL，于80℃水浴放置6 h，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL中和，再加流動相定容至10 mL，即得。

2.4.4 堿破壞樣品溶液取樣品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，取上述溶液5 mL，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2.0 mL，于80℃水浴放置6 h，加1 mol/L鹽酸溶液2.0 mL中和，再加流動相定容至10 mL，即得。

2.4.5 氧化破壞樣品溶液取樣品100 mg，置于100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，取上述溶液5 mL，加入30%過氧化氫溶液1 mL，搖勻，于50℃水浴放置10 min，再加流動相定容至10 mL，即得。

取上述各樣品溶液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，樣品在酸、堿、光照以及高溫條件下均較為穩定，基本無降解產物產生，在氧化破壞條件下可產生兩個較為明顯的降解產物；但降解產物與主峰以及雜質峰間均能達到基線分離。

2.5 線性關系考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液1、1、1、1、1 mL，分別置于100、50、25、20、10 mL量瓶中，加流動相定容，搖勻，即得系列混合對照品溶液。取上述系列混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以雜質1、2、3質量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得雜質1回歸方程為y＝3.342×104x－1 269（r＝0.999 9）、雜質2回歸方程為y＝3.122×104x－322.4（r＝0.999 9）、雜質3回歸方程為y＝3.267×104x－706.3（r＝0.999 9）。結果表明，雜質1、2、3檢測質量濃度線性范圍分別為0.075 60～7.560、0.081 40～8.140 、0.099 24～9.924 μg/mL。

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of destructive test

2.6 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1時，得LOQ；當信噪比為3∶1時，得LOD。結果，雜質1、2、3的LOQ分別為0.075 60、0.081 40、0.099 25 μg/mL，LOD分別為0.022 68、0.024 42、0.029 77 μg/mL。

2.7 精密度試驗

取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，雜質1、2、3峰面積的RSD分別為0.98%、1.02%、0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩定性試驗

取“2.2.2”項下供試品溶液（批號：20140901）適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，只檢出雜質1，其峰面積的RSD＝1.03%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.9 重復性試驗

取樣品（批號：20140901）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算有關物質含量。結果，只檢出雜質1，其含量的平均值為0.012%，RSD＝1.52%（n＝6），表明本試驗重復性良好。

2.10 回收率試驗

取低、中、高質量的雜質1、2、3對照品，分別置于100 mL量瓶中，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率，結果見表2。

2.11 樣品有關物質測定

取各批樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算有關物質含量，結果見表3（表中“-”為未檢出）。

3 討論

3.1 流動相的選擇

筆者根據鹽酸氯卡色林的pKa值（pKa＝9.53），選用經典的緩沖鹽體系（磷酸二氫鈉溶液）與有機相探索合理的配比，最終確定本試驗的流動相為磷酸二氫鈉溶液（取磷酸二氫鈉二水合物5.6 g，加水1 000 mL使溶解，再加三乙胺調pH為6.5）-乙腈。

3.2 檢測波長的選擇

在預試驗中筆者進行紫外掃描，發現鹽酸氯卡色林原料藥的主成分在220 nm波長處有較大吸收，起始原料、各中間體、終產品在220 nm波長處摩爾吸收系數比接近1∶1，且其他波長處均未檢測到較大雜質。隨后筆者取“2.2.1”項下的單一對照品貯備液進行驗證，發現雜質1、2、3在220 nm波長處均有較大吸收。因此，本試驗最終確定檢測波長為220 nm。

3.3 色譜系統耐用性考察

本試驗分別考察了在柱溫變化（±5℃）、流速變化（±0.1 mL/min）、鹽濃度變化（±0.005 mol/L）、pH變化（±0.1）、有機相加入比例變化（±5%）以及不同批號色譜柱和不同儀器條件下樣品分離度及雜質檢出個數，以對分析方法的耐用性進行驗證。結果表明，在色譜條件發生微小變動的條件下，雜質種類、含量及分離度基本無變化，表明本方法耐用性良好。