HPLC法測定泊沙康唑原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

李曉琴，李楠，張曉，劉宇，賈愛瓊，劉瑜（成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，成都610052）

泊沙康唑（Posaconazole）是一種新型廣譜三唑類抗真菌藥物，2006年于美國上市，主要用于預(yù)防侵襲性真菌感染[1-2]，對念珠菌、曲霉菌、球孢子菌、裴氏著色芽生菌和部分茄病鐮刀菌等有抗菌活性[3]，甚至對極難治愈的接合菌（如毛霉菌、根霉菌等）感染也有抗菌活性[4]。目前，《美國藥典》《歐洲藥典》《中國藥典》均未收載泊沙康唑的相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。國外對于其有關(guān)物質(zhì)的研究多見于原料藥[5-8]及制劑[9]的降解產(chǎn)物，著重有關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)解析；國內(nèi)關(guān)于泊沙康唑的有關(guān)物質(zhì)檢測方法還未見報(bào)道。因此，本文采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測定泊沙康唑原料藥中有關(guān)物質(zhì)的方法，以期為完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A型HPLC儀，包括LC-20AT泵、SIL-20A自動進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A檢測器、Chromato-Solution Light色譜工作站（日本Shimadzu公司）；FE20型pH酸度計(jì)（瑞士Mettler-Toledo公司）；CPA225D型Sartorius AG十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；優(yōu)普UPT-II-5型超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；SB25-12DTDN型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 藥品與試劑

泊沙康唑原料藥（四川抗菌素工業(yè)研究所自制，批號：20160801、20160802、20160901）；泊沙康唑?qū)φ掌罚ㄋ拇咕毓I(yè)研究所自制，批號：20160802，純度：99.5%）；中間體Ⅰ對照品（四川抗菌素工業(yè)研究所自制，批號：20160725，純度：99.7%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：0.05 mol/L醋酸銨溶液（加醋酸調(diào)節(jié)pH為4.0）（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～3 min，95%→65%A；4～17 min，65%→40%A；18～35 min，40%→10%A；36～40 min，10%→95%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：262 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取中間體Ⅰ對照品10 mg，置于10 mL量瓶中，加乙腈溶解，定容，搖勻，作為中間體Ⅰ對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液1 mL，加乙腈稀釋1 000倍，制成中間體Ⅰ質(zhì)量濃度約為1 μg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取樣品6 mg，置于25 mL量瓶中，加乙腈適量，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz，下同）處理5 min，加乙腈定容，搖勻，即得。

2.2.3 空白對照溶液 取乙腈適量作為空白對照溶液。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取泊沙康唑?qū)φ掌泛椭虚g體Ⅰ對照品各適量，置于同一25 mL量瓶中，加乙腈溶解并定容，制成泊沙康唑質(zhì)量濃度為240 μg/mL、中間體Ⅰ質(zhì)量濃度為2.4 μg/mL的系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液、供試品溶液、空白對照溶液和系統(tǒng)適用性溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度均＞1.5；理論板數(shù)以泊沙康唑峰計(jì)≥17 000，保留時(shí)間約為23 min。結(jié)果表明，其他成分對測定無干擾。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability tests

2.4 破壞性試驗(yàn)

2.4.1 酸破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號：20160801）6 mg，置于25 mL量瓶中，加入1 mol/L的鹽酸溶液2 mL，于60℃水浴中放置3 h，冷卻至室溫，用1 mol/L氫氧化鈉溶液中和，加入乙腈適量，超聲處理5 min使溶解，再加乙腈定容，搖勻，即得。

2.4.2 堿破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號：20160801）6 mg，置于25 mL量瓶中，加入1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，于60℃水浴中放置3 h，冷卻至室溫，用1 mol/L的鹽酸溶液中和，加入乙腈適量，超聲處理5 min使溶解，再加乙腈定容，搖勻，即得。

2.4.3 氧化破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號：20160801）6 mg，置于25 mL量瓶中，加入20%過氧化氫溶液2 mL，于60℃水浴中放置3 h，冷卻至室溫，加入乙腈適量，超聲處理5 min使溶解，再加乙腈定容，搖勻，即得。

2.4.4 高溫破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號：20160801）6 mg，置于25 mL量瓶中，在120℃條件下放置24 h，冷卻至室溫，加入乙腈適量，超聲處理5 min使溶解，再加乙腈定容，搖勻，即得。

2.4.5 光照破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號：20160801）6 mg，置于25 mL量瓶中，在強(qiáng)光（4 500±500）lx照射條件下放置24 h，加入乙腈適量，超聲處理5 min使溶解，再加乙腈定容，搖勻，即得。

取上述各破壞樣品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖2。由圖2可知，樣品在酸、堿、高溫和光照條件下均比較穩(wěn)定，對氧化條件比較敏感，但樣品在各破壞條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物峰與主峰均能達(dá)到基線分離，且各有關(guān)物質(zhì)間的分離度良好。

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of destructive test

2.5 線性關(guān)系考察

精密稱取“2.2.1”項(xiàng)下對照品貯備液適量，逐級稀釋成質(zhì)量濃度分別為 5.0、2.5、1.0、0.5、0.25、0.1、0.085、0.05 μg/mL的系列對照品溶液，取上述系列對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以中間體Ⅰ質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝45 983x+52.47（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，中間體Ⅰ檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.05～5.0 μg/mL。

2.6 定量限（LOQ）與檢測限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD。結(jié)果，中間體Ⅰ的LOQ為0.05 μg/mL，LOD為0.013 μg/mL。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，中間體Ⅰ峰面積的RSD＝0.77%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20160801）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、16、20、22、24 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，中間體Ⅰ峰面積的RSD＝0.78%（n＝8），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：20160801）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算中間體Ⅰ含量。結(jié)果，中間體Ⅰ含量的平均值為0.31%，RSD＝1.14%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

取低、中、高質(zhì)量的中間體Ⅰ對照品適量，各3份，分別置于25 mL量瓶中，加乙腈定容，搖勻，即得。取上述溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery tests（n＝9）

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測定

取3批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算有關(guān)物質(zhì)的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Results of related substance determination（n＝3，%）

3 討論

3.1 流動相的選擇

筆者考察了不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液-乙腈、醋酸鹽緩沖溶液-乙腈作為流動相進(jìn)行梯度洗脫的情況。結(jié)果，醋酸鹽緩沖溶液-乙腈流動相體系能改善色譜的分離度，使主峰與相鄰雜質(zhì)峰有效分離，進(jìn)一步考察，最終確定0.05 mol/L醋酸銨溶液（加醋酸調(diào)節(jié)pH為4.0）-乙腈為本試驗(yàn)的流動相。

3.2 中間體Ⅰ和雜質(zhì)總量的限度

中間體Ⅰ是泊沙康唑原料藥新合成路徑下的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，而且也是該原料藥用本方法檢測有關(guān)物質(zhì)時(shí)最大的已知雜質(zhì)，根據(jù)現(xiàn)有工藝及3批樣品測定結(jié)果，將中間體Ⅰ作為已知雜質(zhì)進(jìn)行控制，限度暫定為0.5%；同時(shí)，泊沙康唑原料藥的雜質(zhì)總量不應(yīng)超過1.5%。由于該工藝目前仍處于研發(fā)階段，將通過后續(xù)相關(guān)研究進(jìn)一步確定泊沙康唑原料藥的雜質(zhì)控制限度。

綜上所述，本方法操作簡便、結(jié)果準(zhǔn)確，適用于泊沙康唑原料藥中有關(guān)物質(zhì)的測定。

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