培養基模擬灌裝試驗相關缺陷分析與改進建議

毛 紅

（重慶市藥品技術審評認證中心，重慶 401120）

《藥品生產質量管理規范（2010年修訂）》[1]（以下簡稱GMP）及《無菌藥品附錄》[2]要求，非最終滅菌藥品的無菌工藝驗證應進行培養基模擬灌裝試驗。該試驗是指采用微生物培養基替代產品（無菌粉末分裝的培養基模擬灌裝試驗是將產品替代品溶于培養基中）對無菌工藝進行評估的驗證技術，它解決了無菌檢查不能復檢的問題，灌裝批量即為無菌檢查取樣量，更能體現污染率問題[3－4]。該試驗是非最終滅菌藥品GMP管理中一項重要的驗證工作。2014年至2015年，國家食品藥品監督管理總局食品藥品審核查驗中心在組織的無菌藥品生產企業的GMP認證檢查缺陷中，共發現與培養基模擬灌裝相關的缺陷項378條。本研究中對這些缺陷項進行了分類匯總和梳理，現報道如下。

1 缺陷項目分類及分析

選取近年來收集的與培養基模擬灌裝試驗相關的378條認證檢查缺陷，出現頻次較高的缺陷分為人員與培訓、方案設計、培養基及培養條件、記錄缺失、最差條件、干擾設計、偏差調查7個方面。

人員與培訓：無菌藥品生產中，人是最大的污染源，操作人員應始終按無菌技術操作，并在日常操作中努力降低風險[5－6]。檢查中人員與培訓缺陷主要為試驗中未包括所有日常生產人員；模擬灌裝前未對人員無菌更衣效果進行確認，人員更衣不規范；無菌更衣培訓記錄過于簡單，無視頻資料；未對進入灌裝區域的維修人員、環境監測人員進行表面微生物監測；模擬灌裝后培養基的培養結果由灌裝車間燈檢崗位人員執行，但未對該崗位人員進行微生物學知識和檢查技能的培訓。人員方面的缺陷對無菌藥品最終質量的影響最大。

方案設計：培養基模擬灌裝試驗要求盡可能模擬整個工藝過程，但也要考慮到培養基的生長條件，避免某些工藝抑制微生物的生長。檢查中方案設計缺陷主要為，試驗時按照正常生產工藝充氮氣保護，未考慮氮氣可能對需氧菌的抑菌效果；凍干時真空度過低造成培養基中的水分減少；培養基在凍干箱中溫度降低導致微生物生長抑制，未同步進行促生長試驗；試驗中模擬了開門、停電、停風等會帶來污染風險的操作。試驗應當經過詳細的計劃和良好的組織，以保證真實反映工藝中的污染風險[7]。

培養基和培養條件：培養基和培養條件的選擇對于培養基模擬灌裝試驗的成敗至關重要。檢查中此類缺陷主要為，未對試驗用培養基進行靈敏度試驗；培養結束后，未進行培養基促生長能力試驗；培養條件未嚴格按照微生物的繁殖規律，先低溫、后高溫進行培養，如驗證方案規定“灌裝后的培養基一半置23～28℃的溫度條件下培養7 d，另一半置30～35℃培養7 d，7 d后交換培養”；培養之前未對已灌裝好的瓶子進行倒置和旋轉操作，而是直接采用將瓶子一半正立一半倒置的裝載方式培養，未能確保所有瓶子內的培養基在培養之前均能與瓶壁和膠塞充分接觸；培養室設置的溫控探頭位置與溫度分布試驗結果無對應關系，設置的溫度超標報警系統未進行確認。

記錄缺失：GMP要求，所有與質量相關的活動均應當有記錄，記錄缺失是GMP檢查中普遍存在的問題。常見記錄缺失缺陷主要為，缺少在線懸浮粒子的監測數據和B級背景沉降菌／浮游菌的數據；未記錄操作人員進出潔凈區時間和表面微生物的監測情況；未記錄維修工模擬了哪些操作，帶入了什么工具等；未記錄滅菌后的配液系統、工作服、容器具、西林瓶、膠塞等放置多長時間后使用；對灌裝過程中模擬干預的動作、頻次等的記錄不具體；未記錄報廢品的原因及數量；未記錄針頭更換、設備維修與停機的時間；未記錄所用培養箱的設備編號、培養溫度、放入時間、培養數量等信息；未記錄模擬產品在凍干機中的裝載方式；缺少培養基的批號、配制過程、靈敏度試驗及促生長試驗記錄；操作人員無菌性檢查未記錄取樣時間。

最差條件選擇：最差條件是指與正常生產條件相比，更有可能造成工藝或生產失敗的條件[7]。企業在培養基模擬灌裝試驗中對最差條件常常選擇不當，主要存在的缺陷為，沒有挑戰灌裝器具（包含玻瓶、膠塞、工作服、工器具）滅菌后存放的最長時間；未對實際生產時多臺分裝機同時分裝時的情景進行模擬；未根據企業生產實際情況模擬同一品種同一天內更換批號的操作；試驗前對環境分別進行了乳酸和甲醛的熏蒸，人為制造了良好的生產環境，導致評估結論不準確。

干擾設計：培養基模擬灌裝試驗必須模擬所有正常生產中的活動，如取樣、加塞等，但生產中還有一些意外情況，如倒瓶、卡瓶、故障維修等，所以應按常規生產情況模擬影響無菌的關鍵操作和可能出現的各種干預。檢查中常見干擾設計缺陷主要為，未考慮理瓶期間分裝機隔離門開關次數、裝量檢查、卡塞，班次更替、維修人員進入等干預；缺少更換軌道和更換灌裝頭的模擬；實施干預的次數不能反映正常生產狀況（如正常生產時，每批加膠塞的次數約為30次，但模擬灌裝只設計了12次加塞操作；正常生產時每批產品灌裝過程中會有約16次檢查裝量，但模擬灌裝試驗只設計了12次）；干擾試驗中未包括A級區沉降菌更碟等操作；未模擬設備維修、停機等狀況。

偏差調查：試驗過程中應詳細記錄出現的偏差，并進行調查，但在檢查過程中，常常發現企業缺少偏差調查或偏差調查不充分的情況。常見的此類缺陷問題包括，對試驗中樣品染菌情況的調查不充分，不能確認調查結果與染菌的相關性；試驗中所使用的膠塞與實際生產用膠塞供應商不一致，未按偏差進行處理；試驗完成后未立即進入培養箱培養，而是存放在常溫留樣室數日，對此偏差未開展評估；動態監測懸浮粒子超過警戒限時未進行調查和處理。

2 改進建議與措施

為指導和規范無菌藥品生產企業開展無菌工藝模擬試驗，國家食品藥品監管管理總局食品藥品審核查驗中心2016年1月組織啟動了《無菌工藝模擬試驗指南（無菌原料藥）》和《無菌工藝模擬試驗指南（無菌制劑）》，并于2016年12月向社會公開征求意見，目前尚未正式頒布。GMP的認證實施，使大部分藥品生產企業的管理水平得到了提升，特別是硬件設施的保證有了很大提高。GMP要求企業進行培養基模擬灌裝試驗，以確保無菌生產過程的可靠性，為企業及時識別風險和改進無菌控制措施提供數據支持[8－10]。

針對培養基模擬灌裝試驗相關認證缺陷發生比例較高的7個方面，擬訂具體改進措施如下。

人員與培訓方面：試驗的參與人員應包括日常參與到無菌生產的全部人員，如生產操作、取樣、環境監測和設備設施維護人員，且還需通過文件或其他方式確認各人員可以進入的區域和允許的無菌操作項目。只有經過專門培訓并經批準的人員方可進入無菌生產潔凈區內，只有按照要求參加過培養基模擬灌裝試驗的人員才能直接參與實際生產，并且無菌生產的培訓、人員考核等原則也同樣適用于無菌取樣、微生物分析人員。

試驗方案設計：企業應對無菌生產過程開展系統性風險評估，以充分識別無菌生產過程中潛在的風險點，重點關注操作時限和“開放”操作[11]。

培養基及培養條件：要注意培養基類型的合理選擇及工藝過程中微生物生長的影響，避免出現假陰性結果。培養基一般選用廣譜培養基，如果在環境監控中或在成品的無菌檢查中發現厭氧微生物，則需要評估增加厭氧培養基，為避免培養基因過度滅菌或其他工藝條件造成促生長性能的降低，均應進行促生長能力試驗，試驗用菌應包含藥典要求的6種試驗菌[12]。

記錄缺失：企業應采取上下聯動的方式，首先制訂出合理的操作性強的試驗方案和操作規程，還要同時設計出合理的記錄表格，便于操作人員填寫。完整和準確的記錄能保證藥品放行責任人完全掌握藥品是否能放行的所有信息，便于出現偏差和失敗結果時進行事后調查分析和原因查找[13－14]。

最差條件選擇：值得注意的是，最差條件并不是指人為創造的超出允許范圍的生產狀況和環境，而是可以考慮選擇單批產品無菌生產周期末端、間歇式生產的空調系統重新開啟后或連續生產期間周期性滅菌最長的時間間隔，設備、工器具、無菌器具滅菌后最長的放置時間，培養基在灌裝前保存在儲罐中的最長工藝允許時間，試驗時間涵蓋最長實際生產時間、生產過程人數允許最多等最差條件。并結合生產實際操作過程中出現的各種狀況進行模擬，盡量選擇極端的條件。

干擾設計：干擾措施應模擬實際運行時可能發生的情況，應詳細記錄所有發生的干預措施，但不得挑戰不合理的干預，如模擬停電等情況。

偏差調查：特別是對于發現污染瓶的調查應從人、機、料、法、環各個方面開展，可以借助各種分析工具，以保證調查的全面性和科學性，所有調查均需要詳細記錄，并根據調查結果采取針對性的措施，然后重新進行培養基模擬灌裝試驗。此外，對于污染的調查應將發現的污染微生物進行鑒別，并對上一次培養基模擬灌裝試驗后生產的產品進行充分評估。影響產品無菌的因素相當多，試驗結果的分析和調查是整個試驗的重點與難點，即使結果不合格，仍需進行大量的調查，并采取有效的糾偏措施，不能簡單斷定試驗無效[15]。