大黃和水蛭含藥血清藥物化學實驗研究

高旭光， 翟文生， 楊濛， 馬靜， 宋純東， 李廣

大黃、水蛭的經典配伍應用見抵當湯和抵當丸，出自東漢張仲景《傷寒雜病論》，主治太陽蓄血、陽明蓄血證，具有活血通絡逐瘀之效。本科常用大黃和水蛭配伍治療IgA腎病和紫癜性腎炎可明顯減輕血尿和蛋白尿，改善腎病患兒的預后[1-2]。用藥后大黃和水蛭有效成分能否入血，目前尚缺乏相關的血清藥物實驗研究，2015年版《中國藥典》以大黃素、大黃酚為指標對大黃進行質量控制[3]，次黃嘌呤為水蛭中所含的有效成分之一[4-5]。故我們采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatographic，HPLC)檢測大黃組和水蛭組大鼠血清的有效成分大黃酸和大黃素、次黃嘌呤，為臨床用藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠36只，1.5～2月齡，體質量(200±20)g，由鄭州大學動物實驗中心提供[合格證編號：SCXK(豫)2010-0002]。

1.2 實驗藥品 水蛭顆粒、大黃顆粒(江陰天江藥業有限公司)；生理鹽水(四平巨能藥業有限公司)；10%水合氯醛。以上藥物均購于河南中醫學院第一附屬醫院藥房。

1.3 主要試劑 大黃酸(110757-201009，純度>98%)，大黃素(110756-201010，純度>98%)，次黃嘌呤(140661-201006，純度>99.6%)，均購自中國藥品生物制品檢定所；色譜純：甲醇、乙腈；實驗用水：純凈水，由河南中醫學院第一附屬醫院中心實驗室提供。

1.4 主要儀器 超高效液相色譜儀：Waters Acquity H-class；TGL-16B離心機(上海安亭科學儀器廠)；QL-901混勻儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；BF-2000氮氣吹干儀(北京八方世紀科技有限公司)；電子天平：Sartorius-CP225D(1/10萬)(德國賽多利斯)。

1.5 實驗方法

1.5.1 含藥血清的制備 36只SD大鼠按隨機數字表法分為對照組、大黃組和水蛭組各12只。參照臨床成人用藥劑量估算為實驗動物用藥劑量，給藥劑量=臨床常用量×動物等效面積系數×培養基內血清稀釋度[6]。查表得70 kg人與200 g大鼠的等效面積系數為0.018，選用水蛭3 g，大黃10 g。根據大鼠灌胃常用量10～20 mL/kg及藥物的最大可溶解度，在本實驗中選用的等容灌胃量為20 mL/kg。將水蛭、大黃顆粒劑制成混懸液：大黃顆粒制成0.25 g生藥/mL，水蛭顆粒劑制成濃度0.08 g生藥/mL。對照組同法灌胃等容積生理鹽水。

在預實驗的基礎上，連續灌胃10 d，在灌服最后1劑后2 h，經腹主動脈取血，靜置2 h，3 000 r/min離心10 min后取上層血清，0.22 μm過濾除菌，分裝，-70 ℃冰箱保存備用。

1.5.2 對照組血清供試品的制備 取對照組血清0.3 mL，加甲醇乙腈(3∶1)1.1 mL，渦旋1 min，15 000 rpm離心15 min，吸上清液，用0.22 μm濾膜過濾，取0.7 mL濾液，于40 ℃氮氣流下吹干，殘留物用100 μL流動相溶解，渦旋1 min，15 000 rpm離心10 min，吸上清液，按上述方法測定。

1.5.3 大黃顆粒血清中大黃酸、大黃素的檢測

1.5.3.1 血清樣品的處理取 大黃顆粒血清樣品0.3 mL，加乙腈1.1 mL，余下制備步驟同對照組血清供試品的制備。

1.5.3.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液(85∶15)；流速：0.6 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：5 μL。

1.5.3.3 大黃素、大黃酸對照品的制備 取大黃素、大黃酸適量，精密稱定，分別為0.51 mg、0.74 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得。

1.5.4 水蛭顆粒血清中次黃嘌呤的檢測

1.5.4.1 血清樣品的處理 取水蛭顆粒血清樣品0.3 mL，加乙腈1.1 mL，余下制備步驟同對照組血清供試品的制備。

1.5.4.2 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH-C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：甲醇-水(10∶90)；流速：0.3 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：35 ℃；進樣量：0.5 μL。

1.5.4.3 次黃嘌呤對照品的制備 取次黃嘌呤適量，精密稱定為1.91 mg，置50 mL容量瓶中，加稀乙醇(50%)定容至刻度，即得。

2 結果

2.1 大黃顆粒血清中大黃酸、大黃素的檢測結果 血清對大黃酸的檢出有一定的干擾，大黃顆粒血清供試品未檢出大黃酸；但對大黃素檢出無干擾，血清中可以檢測到大黃素。分別見圖1～4(見封三)。

2.2 水蛭顆粒血清中次黃嘌呤的檢測結果 血清對次黃嘌呤的檢出無干擾，大鼠血清中次黃嘌呤色譜峰較高，可能是水蛭的入血成分，也可能是水蛭顆粒給藥后大鼠自身產生的成分。分別見圖5～7(見封三)。

3 討論

腎臟疾病發病率不斷升高，已經成為一種公共衛生問題[7]。IgA腎病和紫癜性腎炎是小兒腎臟病中常見的類型，都需要長期治療，兩者均為腎小球系膜區或伴有毛細血管襻以IgA為主的免疫球蛋白沉積或僅有IgA沉積，腎小球系膜細胞增生及細胞外基質積聚，導致腎小球腎炎，是腎臟病進展的主要病理過程[8-10]，有效阻止系膜細胞增生及細胞外基質積聚，防止腎小球腎炎發展，目前尚無理想治療方法。

從臨床表現和疾病進程分析，IgA腎病和紫癜性腎炎應歸屬祖國醫學中“尿血”“腰痛”“水腫”“虛勞”“關格”等范疇。腎病患兒病機為本虛標實，血瘀證是最重要的標實證，瘀血為疾病本身的病理產物，也是貫穿腎病始終的病理因素，瘀血不散，血不歸經，進一步損傷脈絡，而造成腎病蛋白尿、血尿反復不愈，故瘀血阻滯是導致本病反復發作或久治不愈的關鍵因素之一。《素問·調經論》云:“瘀血不去，其水乃成”，“孫絡水溢則經有留血”。《金匱要略》提及“血不利則為水，名曰血分”提示脈道血液運行障礙發為水證，易致水腫。唐宗海在《血證論》指出“血與水素本不相離，病血者未嘗不病水，病水者未嘗不病血”，“瘀血化水，亦發水腫，血積即久，亦能化為痰水”，明確提出腎病與瘀血存在密切聯系，血凝則水停，水泛致血瘀。現代醫學的發展，近代醫家更加重視對腎病血瘀證的研究，豐富了中醫腎病血瘀證的理論。腎臟病瘀血形成機制很多，就IgA腎病和紫癜性腎炎而言其瘀血的來源主要有四：其一，來源于出血。大部分該病患者均表現為不同部位的出血，出血必留瘀，瘀血阻絡，妨礙氣血運行，新血不能歸經而外溢肌膚，形成紫斑，即所謂離經之血便為瘀血。其二，來源于熱邪。熱邪為腎炎的啟動病因，熱邪熾盛迫血妄行，血不循經而為瘀。其三，來源于濕邪。濕邪有形，阻礙氣機，氣滯血瘀。其四，來源于臟腑氣機紊亂。病程日久，或氣虛或氣滯或有形之邪阻滯，血運失常而成瘀。大黃和水蛭配伍應用是我們20余年的臨床經驗，臨床中發現大黃和水蛭配伍可以改善IgA腎病和紫癜性腎炎的血瘀狀態，減少血尿和蛋白尿，灌藥后血清中是否含有大黃和水蛭的主要成分。我們采用HPLC檢測大黃、水蛭灌胃的大鼠血清中的大黃酸、大黃素和次黃嘌呤，為臨床用藥提供理論依據。

檢測結果顯示，大黃組大鼠血清含有大黃素，雖然血清對大黃酸的檢出有一定的干擾，未在血清樣品中檢出大黃酸，其原因可能有兩個：一是血清本身對大黃酸有一定的影響，二是大黃酸可能入血后含量太低以至于低于檢測限而未能檢出。但血清供試品中大黃素檢測存在，亦能說明大黃主要成分可以進入大鼠血清；水蛭組在大鼠血清中次黃嘌呤色譜峰較高，可能是水蛭的入血成分，也可能是水蛭顆粒給藥后大鼠自身產生的成分，說明大鼠給藥后血清中含有水蛭主要成分次黃嘌呤，可以產生藥效作用。經高效液相色譜法測定，證實了實驗中的大鼠含藥血清含有大黃和水蛭的主要成分。