貽貝粘蛋白降解的關鍵酶

吳珂，康瑞娟，何利中

（江陰貝瑞森生化技術有限公司，江蘇 江陰 214434）

0 引言

隨著生物技術的進步和組織工程學的發展，越來越多的生物材料被用于醫療領域。這些生物源性材料包括蛋白質（膠原蛋白、貽貝粘蛋白）、多糖類（透明質酸、殼聚糖）以及這些生物大分子與傳統材料復合行程單新材料。這些新材料的應用引發了對其安全性的擔憂，迫切需要制定針對這些材料和相關產品的質量控制標準。2016年，國家重點研發計劃設立了“新一代生物材料質量評價關鍵技術研究”項目，其中針對貽貝粘蛋白標準研究設立了專題，著重研究貽貝粘蛋白材料和產品的降解性能和免疫原性。

生物材料有別于傳統無機或合成材料的特性之一在于其可降解性。生物源性材料降解后產生的氨基酸、多肽、寡糖、單糖等產物，大部分都是人體內原來就存在的物質，因此，很難通過體內研究定量追蹤，需要模擬體內環境建立體外模型，獲得體外研究的數據。

基于構建體外降解模型的需求，本文針對人體的蛋白質水解環境進行了文獻調研，并對其中的關鍵酶的作用進行了綜述。

1 貽貝粘蛋白

貽貝粘蛋白（mussel adhesive protein，MAP）是一種多酚類單一蛋白生物材料。貽貝粘蛋白提取自紫貽貝（blue mussel, Mytilus edulis）的足絲腺，貽貝粘蛋白與高等植物細胞壁中的伸展蛋白（在糖鏈間起連接作用）很相似，是屬于糖蛋白類型的一種粘液蛋白，具有超強的黏著性能。貽貝粘蛋白分子由 70-90個重復的多肽片段組成, 每個肽段由 10 個氨基酸組成，其中 2 個是賴氨酸。這使得蛋白具有較高的等電點，在人體生理 pH 值下帶有很強的正電荷。每個貽貝粘蛋白分子帶 150 以上正電荷。另外，貽貝粘蛋白肽鏈片段中有 10% 的 DOPA 基團 (3,4- 二羥基苯丙氨酸)。在 pH 值 5 及以下, 蛋白溶液可以穩定存。但在pH 值較高的情況下，DOPA 中的一些酚羥基氧化成醌，這一過程在兒茶酚氧化酶存在下會被加速。氧化的 DOPA 和未氧化的 DOPA 交聯，形成高分子網狀聚合物[1-3]。

由于賴氨酸及多巴基團的存在，貽貝粘蛋白可通過靜電相互作用吸引帶負電荷的表皮細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、神經細胞等的貼壁和爬行替代，形成創面保護膜和帶有正電荷的網狀支架用于促進創面的愈合。也可作為組織粘合劑用于閉合皮膚組織、閉合黏膜組織、閉合骨組織，以及血管、神經、肌肉、軟組織等的治療。貽貝粘蛋白創面修復敷料是目前已知的唯一含有多巴集團的天然蛋白產品，具有抗炎、促進創面愈合、止癢、抑制黑色素；可用于外科、婦產科、燒傷科、整形科、皮膚科、激光美容等多個科室使用。適用于淺表性創面的防護，臨床淺II度燒傷創面的防護和治療。在體液滲出情況下，貽貝粘蛋白創面修復敷料可以牢固結合于創面，形成微觀、非連續、納米級、帶有正電荷的生物支架，通過靜電相互作用吸引帶負電荷的表皮細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞、神經細胞等的貼壁和爬行替代，促進創面的愈合，且不影響體液的滲出和水蒸氣、氧氣、二氧化碳等的通透。

當貽貝粘蛋白材料所形成的醫療器械產品與體液和組織接觸后，尤其是長期接觸的情況下，存在著被降解的風險。因此，貽貝粘蛋白在體內的穩定性以及可能的降解產物及其去向成為其安全性評價的關鍵。人體不同器官組織的酶環境差異巨大，貽貝粘蛋白在降解的不同階段，其物質種類、分子量、形態、厚度、通透性、免疫原性、細胞毒性、皮內刺激等存在顯著差異。因此，對于貽貝粘蛋白降解的研究宜采用體內體外研究相結合的方式進行。首先構建體外模型，通過體外試驗(例如組織、勻漿、細胞或酶復合液)研究確證有降解產物，然后再利用動物試驗進行毒代動力學研究，描述外來化合物隨著時間的變化在體內吸收、分布、代謝和排泄的情況。因此，了解體內蛋白質水解環境，明確參與外源蛋白水解的酶的種類，就成為構建體外降解模型的先決條件。

2 蛋白酶概述

蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱，蛋白質（大分子）在蛋白酶的作用下分解成氨基酸、多肽等小物質。蛋白酶廣泛存在于動物內臟、植物莖葉、果實和微生物中。生物體的生理活動和疾病的發生，如食物之消化吸收、血液之凝固、溶血作用、炎癥、血壓調節、細胞分化自溶、機體衰老、癌癥轉移、生理活性肽的活化等，莫不與蛋白酶有關。

作為一種重要的生物活性物質，蛋白酶有多種分類方法：按其水解多肽的方式，可以將其分為內肽酶和外肽酶；以最適pH的方式，分為中性蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶；按來源可分為動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶；以活性中心來劃分，可分為半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、天門冬氨酸蛋白酶四大類[4]。學術上通常以活性中心來劃分蛋白酶。見圖1。

圖1 蛋白酶分類圖[5]

3 皮膚中的蛋白酶

到目前為止，貽貝粘蛋白產品主要應用于皮膚創傷和疾病的治療，因此，我們的調研重點也就集中于皮膚中蛋白酶的種類和作用。研究表明，在人體皮膚的表皮層中存在著一個完整的蛋白水解網絡，由超過30種酶組成，執行著越來越多的基本功能[5]。這些蛋白酶及其抑制劑分布于表皮各處，它們之間的精妙平衡維持著皮膚的正常功能，酶與抑制劑之間的調控失衡是導致皮膚各種病理狀況的主要原因。

皮膚的表皮層又可以分為角質層(stratum corneum)、顆粒層(stratum granulosum)、棘層(stratum spinosum)和基底層(stratum basale)，每一層中都含有不同的蛋白酶和抑制劑，它們駐留在各種細胞室，包括細胞器內，錨定到細胞膜上，分布在細胞外基質間。圖2是表皮層蛋白酶及其抑制劑的示意圖。其中不同家族的蛋白酶和相應的抑制劑用同一種顏色表示。主要的蛋白酶類有金屬蛋白酶（紅色）、絲氨酸蛋白酶（藍色）、半胱氨酸蛋白酶（橙色）、天冬氨酸蛋白酶（綠色）以及紫色的扁菱形蛋白酶irhom2[6]。這些蛋白酶參與角質細胞的分化與成熟（例如ADAM17 （在高爾基體中被Furin 蛋白酶激活，參與后期的細胞成熟化過程，如表皮生長因子EGF及其配體的調節），ADAM17缺乏會導致炎癥性皮膚和腸綜合征）；參與信號轉導過程（例如ADAM10 (與分化初期核信號傳導途徑相關，剪切E-cadherin(鈣黏著蛋白)，從而促進β-連環蛋白轉移至內核中并激活下游目的基因的表達)。此蛋白功能的缺失會導致網狀肢端色素沉著）；維持正常的皮膚功能（例如半胱天冬酶 caspase 14，缺失會導致角質延遲或角化不全）；這些蛋白酶的活性都受抑制劑的調節。

在非炎癥條件下，兩種主要的蛋白酶負責健康皮膚的大部分蛋白水解活性，即激肽釋放酶(KLK)5和7。蛋白酶抑制劑LEKTI（淋巴上皮Kazal型相關抑制劑）在正常條件下調節這兩種蛋白酶的活性[7]。大多數組織蛋白酶通常作為無活性蛋白酶分泌，然后在組織中被激活。 其一個例子是皮膚中的三種主要的激肽釋放酶5,7和14的激活。它們都以非活性狀態分泌，然后在組織中活化。激肽釋放酶5通過自我裂解以低速自動激活。活化的激肽釋放酶5然后激活激肽釋放酶7和14，活化的激肽釋放酶14反過來激活激肽釋放酶5和7，從而加速激活。所有這些都受到組織中蛋白酶抑制劑的量的調節，如何維持這種平衡還沒有完全闡明，也幾乎不可能確定，因為這種微妙的活化和抑制之間的平衡是依賴于各成分的局部濃度[8]。

圖2 表皮中的蛋白酶及其抑制劑[6]

由圖2可見，表皮的正常功能主要是由絲氨酸蛋白酶及其抑制劑維持，是表皮層中最重要的一類蛋白酶。絲氨酸蛋白酶是一個以絲氨酸為活性中心的重要蛋白酶家族，它們的作用是斷裂大分子蛋白質中的肽鍵，使之成為小分子蛋白質。在哺乳類動物里面，絲氨酸蛋白酶扮演著很重要的角色，特別是在消化，凝血和補體系統方面。胰蛋白酶就是其中最具代表性的一種。

4 胰蛋白酶

胰蛋白酶Trypsin （Parenzyme）為蛋白酶的一種，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切[9]。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它是不可缺少的工具。胰蛋白酶專一作用有堿性氨基酸精氨酸及賴氨酸羧基所組成的肽鍵。酶本身很容易自溶，由原先的β-胰蛋白酶酶轉化為α-胰蛋白酶，再進一步降解為擬胰蛋白酶，乃至碎片，活力也逐步下降而喪失。

胰蛋白酶能選擇地水解蛋白質中由賴氨酸或精氨酸的竣基所構成的肽鏈，能消化溶解變性蛋白質，對未變性的蛋白質無作用，因此，能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創面凈化，促進肉芽組織新生[10]，此外還有抗炎癥作用。

5 結論

貽貝粘蛋白產品目前的適應癥主要集中在皮膚淺表創面的防護，而皮膚中主要的蛋白酶是絲氨酸蛋白酶。因此，我們可以利用絲氨酸蛋白酶的代表-胰蛋白酶研究貽貝粘蛋白的降解，從而了解貽貝粘蛋白的降解特性，為貽貝粘蛋白產品的開發和應用提供依據。

[1] Haeshin L, Norbert F.S, Phillip B.M. Single-molecule mechanics of mussel adhesion [J].Pnas, 206,103(35):129-1303.

[2] Waite J.H, Benedict C.V. Asay of Dihydroxyphenylalanine(Dopa) in Invertebrate Structural Proteins [J]. Methods in Enzymology,1984,107:397-413.

[3] YuM,HWANGJ, DEMINGTJ.Roleof L-3,4-Dihydroxyphenylalanine in Mussel Adhesive Proteins [J].J Am Chem Soc,19,121:5825-5826.

[4] 胡學智,王俊.蛋白酶生產和應用的進展[J].工業微生物,2008,38(4).

[5] 徐曉峰(導師:冷云偉).重組胰蛋白酶大腸桿菌的發酵與表達[D].中國礦業大學碩士論文, 2016.

[6] De Veer, Simon J, Furio, et al. Proteases: common culprits in human skin disorders.Trends in Molecular Medicine , 2014, 20(3):166-178.

[7] Kasparek P, et al. KLK5 and KLK7 Ablation Fully Rescues Lethality of Netherton Syndrome –Like Phenotype[J]. PLOS Genetics, 2017,13,1.

[8] Prassas I., Eissa A., Poda G., et al. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein- related serine proteases[J]. Nature Reviews Drug Discovery, 2015 (14): 183-202.

[9] 鄧菊云.微生物堿性蛋白酶研究進展[J].現代食品科技,2008,24(3).

[10] 汪世華,王文勇,黃益洲,等.絲氨酸蛋白酶研究進展[J].福建農業學報,2007,22(4): 453-456.