樹突狀細胞與調節性T淋巴細胞在兒童再生障礙性貧血中的作用研究

劉志強 ，夏昱 ，陶敏 ，柯江維

再生障礙性貧血（AA）是一組由化學、物理、生物因素及不明原因引起的骨髓造血干細胞及造血微環境損害，骨髓造血功能低下及全血細胞減少的疾病。引起AA發生的確切原因尚不明了，目前越來越多的臨床觀察和實驗研究表明，免疫系統紊亂在AA的發生、發展中起著重要的作用，第46屆美國血液學年會明確提出AA是自身免疫性疾病，免疫異常表現在T淋巴細胞功能亢進[1]。DCs是適應性免疫的主要啟動者，是體內最重要的專職抗原提呈細胞（APC），在免疫應答的誘導中具有獨特的地位。Treg細胞是一種調節性的T細胞，其主要功能為抑制效應T細胞，維持免疫耐受，預防自身免疫性疾病發生。本研究采用流式細胞術分析AA患者外周血DCs和Treg細胞數量的變化及兩者的相關性，為進一步探討AA發病的免疫學機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2013年1月至2017年4月期間我院血液科收治的初診再生障礙性貧血患兒31例為病例組，其中男19例，女12例，年齡3至14歲，平均年齡8歲9個月。以上病例的診斷均參照國際再障診斷標準[2]。同期來我院門診健康體檢兒童26例為對照組，其中男15例，女11例，年齡4至13歲，平均年齡9歲1個月。兩組間性別、年齡差異無統計學意義，具有可比性。

1.2 檢測方法

1.2.1 標本采集 采集AA初診患兒及健康對照組兒童靜脈血lml，置含肝素抗凝管中，標本2h內檢測。

1.2.2 淋巴細胞CD系列表達檢測 每份待測標本分三管，相應取美國BD公司CD4-FITC、CD25-APC、CD127-PE，Lin2 （CD3、CD14、CD19、CD20、CD56）FITC 混 合 抗 體 ，HLA-DR-PerCP、CD11c-PE-cy7、CD123-APC鼠抗人熒光單克隆抗體10ml，加入肝素抗凝血100μl，混勻，室溫避光孵育20min，分別加入1×紅細胞裂解液1ml，室溫避光放置 10min，1000r/min離心 5min， 棄上清液，用PBS洗滌2次，棄上清，加PBS 250μl懸浮細胞，上機檢測。采用BD公司FACSCanto流式細胞儀檢測，BD FACSDiva軟件進行數據分析。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件處理， 數據以均數±標準差（x±s）表示表示，組間均數比較采用配對和成組設計t檢驗，相關性分析應用Pearson檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 研究對象的相關信息

2.1 外周血DC1和DC2占淋巴細胞的百分比 本實驗通過對兒童AA的研究亦發現AA患兒外周血DC1占淋巴細胞的百分比高于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；而外周血 DC2 占淋巴細胞的百分比與健康對照組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。 見表 1。

表1 外周血DC1和DC2占淋巴細胞的百分比

2.2 外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比 AA患兒外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。 見表 2。

表2 外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比

2.3 外周血DC1和Treg的相關性 分析顯示AA組和對照組DC1和Treg細胞在數量上呈負相關。見表3。

表3 DC1和Treg細胞水平對比及相關性分析

3 討論

目前認為T淋巴細胞異?；罨?、功能亢進不僅參與了兒童感染性疾病的發生、發展[3]，亦是造成骨髓損傷、造血細胞凋亡及造血功能衰竭的主要原因。Treg細胞為CD4+T細胞的亞群，它們通過細胞間接觸和分泌抑制性細胞因子(TGF-β、IL-10等)方式發揮抑制功能[4]。Treg細胞的抑制性功能在維持機體內環境穩定、誘導免疫耐受及防止AID的發生方面起著重要作用。有研究顯示在急性白血病、特發性血小板減少性紫癜等血液系統疾病中存在Treg數量和功能的異常[5，6]。亦有研究表明，AA患者外周血也存在Treg數量和功能的異常。Solomou EE等[7]首次發現，確診再障的患者外周血單個核細胞中Treg細胞數量減低；其中7例接受免疫抑制治療后出現造血應答的患者中，有6例的Treg細胞數量和Foxp3表達水平相對未治療前均輕微升高；而3例接受免疫抑制治療達到完全緩解 (CR)的患者，Treg細胞數量較治療前增加。王西閣等[8]研究也發現，急慢性AA患兒Treg細胞百分均低于對照組，與Solomou EE研究結果一至，且在SAA中Treg細胞比例進一步降低。在對獲得性AA研究中發現，病例組與健康對照組相比CD4+CD25+T細胞、CD4+CD25+FOXP3+T細胞占CD4+T細胞百分比及其絕對值均明顯降低，經免疫抑制治療 (IST)3～6個月后Treg數量比治療前有所提高[7]。提示CD4+CD25+FOXP3+Treg在絕大多數AA患者中都是降低的，隨著IST有效，病情緩解，Treg數量上升。

本實驗通過對兒童AA的研究亦發現AA患兒外周血Treg細胞占CD4+T細胞百分比低于健康對照組。Treg細胞是一類具有重要調節功能的T細胞亞群，具有免疫低反應性和免疫抑制性兩大功能，其正常水平和功能的維持有助于免疫系統對自身抗原的刺激建立良好的耐受狀態[9]。正常狀態下，機體不存在自身免疫反應，最重要的原因就是Treg細胞的存在抑制了自身反應性T細胞的活化。由此推測Treg缺乏，自身反應性T細胞增加，機體免疫耐受被打破，啟動自身免疫應答，免疫效應細胞增多，功能亢進，促進AA發生。

DCs是適應性免疫的主要啟動者，是體內最重要的APC。DCs既能誘導有效的免疫應答，同時在誘導免疫耐受中也十分重要。根據來源不同，DC細胞可以分為DC1和DC2（mDC和pDC）。余詩炎等[10]研究發現結核性胸膜炎患者外周血中mDC比例顯著高于對照組，胸腔積液中mDC比例高于外周血。重型AA患者的骨髓中，未成熟的和激活的DC1均明顯增加，且兩者比例失衡，促進Th0細胞向Th1型分化，使自身免疫耐受被打破、T細胞功能亢進而導致造血功能衰竭[11]。此外，還發現初發重型AA患者外周血中髓系DC前體（pDC1）顯著增多，并且pDC1與淋巴細胞系DC前體（pDC2）比值明顯失衡，與正常對照組存在差異；而在恢復期時上述指標下降，與正常對照組差異無統計學意義[12]。Liu等[13]采用蛋白質組學技術分析mDC蛋白表達，經質譜鑒定發現葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)和丙酮酸激酶M2型蛋白(PKM2)在初治SAA患者mDC中表達上調；其中PKM2在進一步鑒定中發現，無論是蛋白水平還是mRNA水平在SAA患者mDC內表達均明顯增高。

本實驗通過對兒童AA的研究亦發現AA患兒外周血DC1占淋巴細胞的百分比高于健康對照組，差異有統計學意義；外周血DC2占淋巴細胞的百分比與健康對照組比較，差異無統計學意義。DC1分泌白細胞介素-12（IL-12）使機體的免疫應答反應加劇，促使Th0向Th1細胞分化并促進Th1細胞分泌γ干擾素（IFN-γ），進一步加劇了機體的免疫應答反應，從而促進AA發生。DC2則分泌IL-4，使Th0向Th2細胞分化，但DC2主要與B淋巴細胞功能有關，具有一定的吞噬、攝取、加工抗原的能力，但抗原呈遞能力低。由此可知，AA患者的DC亞群存在異常，其與激活Th1細胞相關的DC1明顯增多相關。這表明AA患者骨髓中DC1處于功能亢進狀態，可能是導致AA疫耐受被打破的重要因素。而抗原刺激則有可能是激活AA患者DC1，進而誘導免疫“瀑布”反應的始動因素。

本實驗通過進一步研究還發現，AA組和對照組DC1和Treg細胞在數量上呈負相關。一般認為，DCs誘導產生效應性T細胞還是調節性T細胞在很大程度上取決于其成熟狀態，即DCs/imDCs的比例[14]。有研究表明，來源胸腺的Treg細胞的產生，不需要和專門的DCs相互作用，而主要與胸腺內皮細胞和自身抗原有關[15]。亦有研究[16]認為AA患者骨髓中B淋巴細胞可以通過協同刺激因子影響Treg細胞導致T淋巴細胞異常活化，進而使骨髓造血功能衰竭。另外，調節性T細胞的產生依賴于所處的環境，在一定的環境下，T細胞遇到自身或外源抗原，由于DCs表面的協同刺激分子的表達改變或者細胞因子的格局變化亦可影響T細胞分化為調節性T細胞。有關DCs與Treg相互作用的分子機制還不很清楚，涉及的層面和環節非常復雜，還有待于進一步研究。