環狀核糖核酸的生物功能及其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中的研究進展

畢蓮茹、王寶、羅南、侯秀偉、陳慶宇、廉瑞、趙洋綜述，宋春莉審校

環狀RNA（Circular RNA，circRNA）是一類特殊的非編碼內源性RNA（Nocoding RNA，ncRNA），具有閉合環狀結構且大量存在于真核轉錄組中的非編碼RNA。circRNA具有很強的組織特異性，且越來越多的研究表明circRNA在轉錄、轉錄后及翻譯過程中均發揮著重要的作用[1]。早在20世紀70年代，Sanger等[2]就在植物類RNA病毒中發現了circRNA，但由于當時科技水平的限制，僅把其當作基因轉錄過程中發生錯誤剪接形成的產物而未給予重視[3]。直到近幾年來隨著生物信息學的快速發展和高通量測序技術的不斷革新，circRNA的數量和部分功能才被學者們不斷發現。環狀RNA是一類閉合環狀RNA分子，由于無 5' 端帽子結構及 3' 端 ，也無多聚A 尾，不受 RNA外切酶的降解，因此可以穩定且廣泛地存在于生物界，具有進化保守性[4]。環狀RNA按照來源主要分為外顯子環狀RNA（exon circRNA，ecircRNA）[5]、內含子環狀 RNA（intron circRNA，ciRNA）[6]、外顯子內含子環狀RNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）[7]三類。本文主要介紹環狀RNA的生物功能及其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病中研究進展。

1 環狀RNA的形成機制及其生物學功能

1.1 環狀RNA的形成機制

目前環狀RNA形成的機制主要有三種形式[8]：（1）內含子配對驅動環化（intron-pairing-divern circularization），也叫直接反向剪接：主要機制是前體mRNA兩側的內含子通過堿基互補配對發生環化再切除內含子，從而形成環形RNA（circular intron RNA，ciRNA）；（2）套索驅動環化（lariat-driven circular），也被稱為外顯子跳讀（exon skipping）：主要機制是外顯子跳讀，即前體mRNA 下游外顯子的剪接供體（splice donor，SD）的3′端連接到pre-mRNA上游外顯子的剪接受體（splice acceptor，SA）的5′端形成套索結構，然后切除內含子形成環狀RNA[9]；（3）內含子兩端的互補序列形成環形RNA：而對于內含子來源的環形 RNA則依賴于內含子兩端的互補序列形成環形RNA，ciRNA的形成要求5’端剪接位點富含7nt GU序列，3’端富含11nt C序列，兩者共同作用使得內

含子首尾相連，形成ciRNAs[6]。其中前兩種已得到廣泛認可，是ecircRNA主要形成方式，若沒有切除內含子則形成EIciRNA[7]。

還有一種學說認為環狀RNA通過RNA結合蛋白配對驅動的環化，即由結合在前體mRNA上內含子兩側的互補序列上的RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）相互作用形成環狀結構，促進頭尾兩端的終末連接，最后形成circRNA 或 EIciRNA[10]。

1.2 環狀RNA的生物學功能

1.2.1 作為 微小RNA 分子的海綿體

近些年研究發現eiRNA主要存在于細胞質中，可以作為micro RNA的分子海綿從而發揮相應的功能[11]。已知miRNA是由約22個內源性非編碼的核苷酸組成，可以和與之互補的mRNA結合，抑制其翻譯或促進其降解，從而實現對基因表達的負性調節效果[12]。例如小腦變性相關蛋白1（cerebellar degeneration-related protien 1）的環形反義轉錄物CDR1as含有大約 70 個 miRNA-7（microRNA-7，miR-7） 的結合位點，可以和miR-7大量結合，抑制其活性導致 miR-7 靶基因的表達水平增加[13]。已有實驗表明[14]，CDRlas會損害斑馬魚的中腦功能，產生與miR4敲降類似的效果；而當CDR1as 低表達時，miR-7 的靶基因表達水平也相應降低。因此，CDR1as 又被稱為 miR-7 的分子海綿。Hansen等[15]研究發現小鼠睪丸中存在環狀Y染色體性別決定區基因 （circular sex-determining region Y，circSRY），該基因含有16個miRNA-138結合位點，可以和miRNA-138結合，抑制其活性，從而調控miRNA-138的表達水平。Zheng等[16]發現環狀同源結構域相互作用蛋白凝酶3（circ-HIPK3）作為人類細胞的細胞生長調節劑，可作為mi-RNA的分子海綿，直接結合并抑制活性miR-124表達，已知circ-HIPK3在膀胱癌組織和細胞系顯著下調，分別與膀胱癌分級、浸潤及淋巴結轉移呈負相關，研究發現circ-HIPK3有miR-558兩個結合位點，可以充當miR-558的分子海綿[17]。由此可見環狀RNA作為miRNA的分子海綿是一種普遍現象。

1.2.2 與蛋白質相互作用

環狀RNA具有蛋白吸附功能，可以作為蛋白質海綿發揮功能。Ashwal-Fluss等[18]研究顯示環狀盲肌基因（circMBL）是由盲肌編碼基因第二個外顯子環化形成的，其側翼內含子上有許多盲肌蛋白結合位點。當MBL水平升高時，MBL與pre-mRNA結合，促進MBL編碼基因環化形成circMBL，同時抑制MBL基因經典剪接過程來降低MBL的水平；而新生成的circMBL 再吸附多余的MBL，使MBL水平降低，Ashwal一Fluss等發現肌強直營養不良（myotonic dystrophy，MD）可能與上述機制有關。還有CDR1as 和SRY circRNAs可與miRNA 效應因子阿格蛋白（Argonaute， AGO） 相結合，從而被降解[14，19]。

1.2.3 參與細胞周期及細胞衰老調控

例如circ-Foxo3 可以與周期蛋白依賴性激酶2（cyclindependent kinase2，CDK2）、周期蛋白依賴性激酶抑制劑（cyclin-denpendent kinase inhibitor1，p21 ）形成復合體，p21可以阻礙CDK2與周期蛋白A、周期蛋白E結合，從而抑制細胞進入細胞周期[9]。circ-Foxo3與抗衰老相關蛋白分化抑制因子1（inhibitor of differentiation -1，ID1）、E2F轉錄因子1（E2F1）及抗應激蛋白粘著斑激酶（facal adhesion-associated protein kinase，FAK）、低氧誘導因子1α（HIF1α）結合，使ID1、E2F1、FAK、HIFa不能進入細胞核或線粒體中發揮抗衰老作用[20，21]。

1.2.4 參與調控基因的轉錄

與外顯子來源的環狀RNA主要存在于細胞質中不同的是，外顯子及內含子共同組成的環狀RNA（exon-intron circ RNA）、內含子來源的環狀RNA（intronic circRNA）主要存在細胞核中，因此ciRNA和EIciRNA可能參與親本基因的調控[6，7]。其中EIciRNA可以與U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）結合形成ElciRNA-U1snRNP復合物，此復合體在與親本基因啟動子上再和聚合酶Ⅱ（P01Ⅱ）結形成ElciRNAU1snRNP-PolⅡ復合體，使RNA polⅡ聚集從而提高親本基因的轉錄。例如有研究發現細胞circEIF3J和circPAIP2可以分別與U1 snRNP通過RNA-RNA方式相互結合，順式調控親本基因的表達[7]；還有研究發現一些ciRNA（ci-ankrd52，ci-sirt7）也可以與U1小核糖核蛋白（U1 snRNP）、RNA聚合酶Ⅱ結合從而促進基因的轉錄。錨蛋白重復結構域52（ciankyrin repeat domain52，ci-ankrd52）是來源于 ankrd52的ciRNA，存在于轉錄點附近，可以與RNA polⅡ結合發揮正向調節作用，從而促進基因的表達，提高ankrd52的轉錄效率；當ci-ankrd52被特異性敲除之后，ankrd52的轉錄效率明顯降低[6]。

1.2.5 其他

有報道指出環狀RNA可以轉錄翻譯蛋白，可能的機制是環狀RNA與核糖體結合并通過滾環復制進行翻譯[22]；Holdt等[23]研究發現circANRIL可以與一種編碼核仁蛋白的基因（pescadillo homolgue 1，PES1）結合，從而抑制PES1與prerRNA結合后介導的核酸外切酶對pre-rRNA的加工，進而影響核糖體的成熟。

2 環狀RNA在冠心病發生、發展過程中的生物作用

2.1 環狀RNA影響血管內膜的粥樣斑塊形成

人類全基因組關聯分析，染色體9p21.3基因單核苷酸多態性與動脈粥樣硬化性心臟病的易感性有關。Burd等[24]發現染色體9p21.3的多態性能影響INK4/ARF基因的轉錄過程。已知INK4/ARF基因可編碼3種已知的抑癌基因p16INK4a、p15INK4b、p14ARF和一條長鏈反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 lous，ANRIL）。 其 中 p16INK4a沉默可導致動脈內皮損傷后內膜增厚，p14ARF沉默可導致粥樣斑塊形成，p16INK4a、p15INK4b參與轉化生長因子β（TGF-β）信號通路，其沉默可導致粥樣斑塊形成[25]。ANRIL可以與多梳蛋白復合物（polycomb repressive complex，PRC）：PRC1、PRC2結合，使PCR1、PCR2與 p16INK4a、p14ARF和 p15INK4a基因結合使組蛋白H3甲基化引起這些基因靜默，將導致血管內膜增生、粥樣斑塊形成等病理性改變。cANRIL是ANRIL轉錄過程中存在“外顯子跳讀”現象環化形成的。Holdt等[23]研究發現冠心病患者體內circANRIL/Lin ANRIL比例較高，而且circANRIL 高表達的患者很少發生冠心病。可能是circANRIL可以與PES1結合，從而抑制PES1與prerRNA結合后介導的核酸外切酶對pre-rRNA的加工，進而促進核糖體的成熟，這將導致核仁應激和p53激活，誘導血管平滑肌細胞和巨噬細胞凋亡和增殖抑制，發揮抗動脈粥樣硬化作用。

2.2 環狀RNA與心肌細胞缺血再灌注損傷

在小鼠缺血再灌煮損傷心肌梗死模型中Geng等[26]發現小腦變性相關蛋白1基因的反義轉錄環狀RNA—CDR1as和miR-7的表達均上調，且兩者的表達水平隨心肌梗死面積的增大而升高。該研究發現CDR1as過表達可以通過激活caspase-3促缺氧誘導的心肌細胞凋亡，而且CDR1as可以通過上調多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1（poly-ADP-ribose polymerase，PARP）和轉錄因子SP1的表達水平來增大心肌梗死的梗死面積，但之后通過miR-7過表達過程使其逆轉。已知PARP和SP1均是miR-7的下游蛋白，可以引起細胞凋亡，是細胞凋亡的執行者[26～28]。這表明，miR-7a能夠作用于其靶標PAPP和SP1，從而保護心肌細胞免受缺氧誘導凋亡。此外，CDR1as在體內的過表達可能加重MI的發展、增加心肌梗死面積，以及顯著上調PARP和SP1，而miR-7a過表達明顯減弱了CDR1as誘導的這些變化。

2.3 環狀RNA參與血管內皮細胞的調節

ZNF609基因表達產物是鋅指蛋白家族成員，其亞型cZNF是內皮細胞高度表達的環狀RNA之一。Chang等[29]發現cZNF609可以通過cZNF609/miR-615-5p/MEF2A信號網參與血管內皮功能的調節。已知cZNF609是miR-615-5p的分子海綿，其相互結合抑制miR-615-5p的活性，促進肌細胞增強因子（myocyte enhancer factor 2A，MEF2A）的表達，MEF2A過表達能模擬cZNF609沉默介導的內皮細胞的遷移、管腔形成并保護內皮細胞免受氧化應激或缺氧誘導的凋亡。已知血管內皮細胞功能紊亂和損傷在冠心病的病理形成過程發揮重要作用。研究發現，與健康的志愿者相比，冠心病患者血液中cZNF609的水平下調；相反，冠心病患者血液miR-615-5p表達水平明顯升高。因此，cZNF609可能通過調節血管內皮細胞的功能來參與冠心病的保護機制。

2.4 環狀RNA參與調節血管平滑肌功能

已知MiR-130a-3p 與冠狀動脈硬化成負相關[30]，其表達下調可以導致患有冠狀動脈疾病患者的內皮祖細胞功能障礙[31]。TRPM3屬于瞬時受體電位（TRP）通道家族，能調節細胞內鈣穩態[32]。Pan等[33]在冠心病患者血漿中確定了24個差異表達的circRNAs（18個上調和6個下調）。其中包括 9 個 circRNAs， 即 hsa_circ_0089378，hsa_circ_0083357，hsa_circ_0082824，hsa_circ_0068942，hsa_circ_0057576，hsa_circ_0054537，hsa_circ_0051172，hsa_circ_0032970， 和 hsa_circ_0006323，這些circRNAs是hsa-miR-130a-3p分子海綿，可以抑制hsa-mir-130a-3p表達，使TRPM3的表達上調，進而與膽固醇一起調節血管平滑肌細胞的增殖與收縮，進而影響心臟血管的收縮功能。可能參與變異性心絞痛的形成過程。

2.5 環狀RNA作為冠心病診斷的生物標志物

環狀RNA是閉合環狀結構，不易被RNA酶水解，比線性RNA穩定[4]，廣泛存在于體液中且位于細胞內，數量大、序列高度保守，具有組織和時間特異性，容易出膜和進入體液，因此，具有作為疾病診斷標志物的潛質[34]。

Burd等[24]研究發現靠近INK4a/ARF基因位點的反義轉錄物——ANRIL與動脈粥樣硬化存在易感性，其在轉錄過程中存在“外顯子跳讀”現象環化形成cANRIL，RNA測序發現大量的環形RNA可以穩定存在于血液中，并且相對容易檢測到，可以作為臨床潛在的疾病標記物[34]。Zhao等[35]從12例冠心病患者和12名對照者的外周血中提取所有RNA進行circRNA基因檢測分析和受試者工作曲線分析發現hsa_circ_0124644的敏感度和特異度最高（分別是86.7%和76.7%）具有生物標志物的診斷價值；當引入了hsa_circ_0098964時，結果表明，hsa_circ_0124644和hsa_circ_0098964組合作為生物標志物對冠心病診斷價值較高。hsa_circ_0124644和hsa_circ_0124644與hsa_circ_0098964相結合的診斷價值高于常規心電圖和運動平板實驗（Treadmill Exercise Test，TET）， 并 約 等 于 Holter監 測。Zou等[36]用DNA試劑盒從342例男性冠心病患者外周血單核細胞中提取出has-cirrc-0041103，研究發現與健康對照組相比，冠心病患者外周血has-cirrc-0041103明顯升高，其敏感度和特異度分別是0.595和0.612，這表明has-cirrc-0041103有望成為冠心病的生物標記物。

3 展望

近年來，環狀RNA的研究已經成為一個新的熱點，隨著研究的不斷深入，環狀RNA的形成機制、生物功能及在冠心病中的作用已嶄露頭角，這為冠心病的診療提供了一個新的思路，使冠心病的研究向精準醫學方向發展，這將更好的造福于人類。然而，由于目前的對環狀RNA的研究還處于初期階段，對于環狀RNA是如何在冠心病中發揮作用的、是否會影響冠心病的預后以及是否可以作為冠心病的診斷標記物而在臨床上得到廣泛應用等，仍是我們未來需要不斷探究的問題。