基于SIRTs/NF-κB信號通路探討中醫藥調控及其對慢性腎臟病的治療機制?

魏明剛，何偉明，熊佩華，孫 偉△

(1.蘇州大學附屬第一醫院中西醫結合科,蘇州 215006； 2. 江蘇省中醫院腎科,南京 210029)

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)已經成為世界范圍內危害公眾健康的常見病和多發病，CKD隨著病情進展則腎功能逐漸減退并最終發展成為終末期腎病(end stage of renal disease, ESRD)，而需要血液凈化或器官移植等維持生命，對社會和家庭造成極大影響[1]，尋找有效的治療手段并闡明其作用機制對于大眾健康和社會發展至關重要。

1 慢性腎臟病發病機制的概述

對于CKD而言，導致病情不斷加重成為ESRD的直接原因是腎臟纖維化，腎臟纖維化的核心是腎間質纖維化(renal interstitial fibrosis, RIF)[2]。RIF 病變中腎小管上皮細胞轉分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)和細胞外基質(extracellular matrix, ECM)代謝失調是其主要原因[3-4]。EMT表現為上皮細胞轉分化為肌成纖維細胞導致組織纖維化，而肌成纖維細胞具有合成和促進ECM的積聚，ECM積聚會進一步加重EMT的程度。也就是說，EMT與ECM代謝失調兩者之間相互影響產生惡性循環導致腎臟纖維化，腎功能逐漸喪失成為ESRD。非感染性炎癥、氧化應激和衰老等是影響CKD產生RIF的重要因素[5-6]。研究表明，調控某些功能蛋白可以一定程度上減輕RIF，延緩CKD病變進展[7-10]。

腎間質是腎小管之間、腎血管以外的腎臟實質性組織，由細胞及ECM組成。細胞主要是間質細胞。ECM主要包括膠原(collagen, COL)和纖維連接蛋白(fibronectin, FN)等五大類，COL是最主要的成分。眾所周知，ECM在腎小球及腎間質過度堆積是腎臟纖維化的主要原因，而EMT與ECM的代謝相互促進。因此，EMT和ECM代謝調控是治療的關鍵問題。對于EMT的調控而言，轉化生長因子-β(transforming growth factor, TGF-β)是最重要的上游細胞因子，smads是其最主要的下游效應物質，smads信號傳導是TGF-β1誘導EMT的關鍵通路[11]。對于腎小球而言，TGF-β1也是公認導致其纖維化病變發生的上游細胞因子。也就是說，TGF-β/Smads細胞信號通路是纖維化病變時影響病變發生發展的主要細胞信號通路[12]。ECM降解酶系中基質金屬蛋白酶系(matrix metalloproteina seseries，MMPs)對ECM有廣泛的降解作用，MMPs是調節ECM代謝平衡最重要的酶系[13]。金屬蛋白酶調控因子(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)由巨噬細胞和結締組織細胞產生，其中TIMP-1能夠抑制所有已知的MMPs活性，從而維持生理狀況下ECM沉積和降解平衡。腎臟纖維化時ECM中富含COLIV，MMP-9是COLIV的特異性降解酶，TIMP-l不僅可與活化的MMP-9結合阻斷其活性，亦可與MMP-9前酶結合阻止其活化，從而導致COLIV在腎臟過度增加而加快腎臟纖維化過程。ECM異常的積聚導致正常組織結構破壞，這種病理現象在腎小球和腎小管間質均存在，腎小球硬化和腎小管間質纖維化導致腎功能喪失[14]。因此，RIF是各種腎小球和腎小管間質疾病的最后結局，是導致ESRD的共同通路。也就是說，ECM調控是延緩甚至逆轉CKD病情發展的核心問題。本研究應用“芪歸益腎方”(qiguiyishen, QGYS)調控ECM代謝的研究發現，方劑及其組分對于ECM代謝的調控作用確切[15]。但這僅僅是研究中發現的現象，其病變機制尚需進行深入探討才能揭示其本質。

2 SIRTs/NF-κB信號通路在慢性腎臟病中的作用

2.1 NF-κB與慢性腎臟病

NF-κB(Nuclear factor-κB, NF-κB)是從成熟的B淋巴細胞中提取，因其能與κ輕鏈基因增強子的κB序列(5-GGG ACT TTC C-3)特異性結合，并促進κ輕鏈基因蛋白的表達，故稱之為核因子κB (NF-κB)[16]。NF-κB家族有5位成員NF-κB1(p50)、NF-κB 2(p52)和RelA(p65)等。它們的N末端均由約300個氨基酸組成的Rel同源區(Rel homology domai-n, RHD) ，故而又稱之為NF-κB/Rel蛋白家族。RHD有發生二聚化和結合DNA等功能。NF-κB/Rel蛋白家族多以同源或異源二聚體的形式存在，不同的NF-κB/Rel蛋白二聚體具有不同的結合序列和功能。NF-κB最常見p50/p65二聚體，NF-κB 廣泛存在于細胞中并調節細胞因子、黏附因子和免疫受體基因等表達，從而影響細胞的分化、炎癥反應和凋亡等[17-18]。TGF-β與上述功能關系密切，而且是公認引起CKD纖維化的主要細胞因子[19-20]。TGF-β直接作用于其下游效應物質smads，進而影響EMT過程和ECM代謝。也就是說，NF-κB通過影響TGF-β/smads信號通路，從而影響腎臟組織纖維化相關的過程和ECM代謝[21]。另外，TGF-β激活激酶1(transforming growth factor β activated kinase 1，TAK1)參與了NF-κB上游的免疫復合物激活，而TAK1也可以被TGF-β1激活。這種相互作用導致纖維化持續惡化最終引起腎功能喪失[22]。靜息狀態下NF-κB與其抑制蛋白IκB(inhibitor of NF-κB, IκB)以非活性的形式存在于胞漿中，細胞的衰老、炎癥或氧化應激等條件下IκB激酶 (IκB kinase，IKK)被激活，從而使IκB經快速磷酸化和泛素化后降解，并暴露出 NF-κB的核定位序列，NF-κB發生核移位并與特定的κB序列結合后引起相應靶基因的轉錄激活。Ricardo等[23]發現，盡管NF-κB不能控制TGF-β1的基因啟動因子，但NF-κB能調節谷氨酰胺轉胺酶(Transglutaminase, TGase)的啟動和轉錄，而在組織中此酶是TGF-β1的激活劑。組織中TGase與基質蛋白交聯，模型動物如果增加此酶的表達不但能加重腎臟纖維化[24]，而且間接誘導 TGF-β1表達增強，從而加重腎臟EMT和ECM聚集。因此，NF-κB與TGF-β1的聯系一定程度上通過調控smads、TAK1和Tgase的表達實現。NF-κB通過TGF-β/smads和TGF-β/TGase信號通路或者受到TGF-β1逆向調控，進而借助TAK1正反饋作用促進腎臟纖維化病變的進展。上述途徑為通過調控NF-κB及TGF-β1表達作用，為達到延緩腎臟纖維化提供了重要的理論支撐。此外，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 (Serine/threonine protein kinase, Akt)是磷脂酰肌醇-3 激酶 (phosphatidyl inositol 3 kinase,PI3K) 的一個下游靶點。Akt可通過增強IκB的磷酸化減少IκB蛋白合成而激活NF-κB，提示Akt的異常激活在此過程中發揮著重要作用[25]。

2.2 Sirtuins對NF-κB的調控

沉默信息調節因子2(silent information regulator 2，Sir2)的相關酶(Sir2-related enzymes，sirtuins)，是近年來在酵母中發現的一類依賴煙堿胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)的組蛋白去乙酰化酶。Sirtuins從單個細菌到人類組織廣泛分布，是一種高度保守性的蛋白。目前人類發現的sirtuin家族成員有7個，分別命名為SIRT1-7,其中SIRT1是與酵母染色質Sir2同源性最高的一個。SIRT1存在于包括人類在內的多種生物體體內，其通過對組蛋白和多種非組蛋白賴氨酸殘基去乙酰化修飾作用干預基因表達，參與細胞衰老、炎癥和免疫調節等生命活動[26]。研究發現，SIRT1參與上述生命活動過程并對機體的影響作用與調控NF-κB的活性密切相關[27-28]。靜息細胞中NF-κB抑制蛋白IκB與NF-κB的P65亞基結合，使NF-κB處于功能失活狀態。細胞在受到刺激后如炎癥因子、活性氧等作用時IκB發生磷酸化被降解，NF-κB恢復活性并通過核膜上的受體進入細胞核與靶基因啟動子相結合，迅速誘導靶基因的轉錄，從而影響機體的生命活動[29-30]。SIRT1可將NF-κB的P65亞基第310位的賴氨酸去乙酰化抑制NF-κB，從而減輕炎癥因子和活性氧誘導的炎癥反應[31-32]。SIRT1與細胞凋亡蛋白1抑制子(cellular inhibitor of apoptosis protein-1, cIAP) 基因啟動子的結合，同樣可導致該區域組蛋白去乙酰化, 使其不再被NF-κB激活，從而達到減輕細胞凋亡的作用[33]。而且，SIRT1陰性表達的巨噬細胞中NF-κB高度乙酰化，導致多種炎性因子表達，從另一個側面說明SIRT1與NF-κB之間的密切聯系[34]。

另一方面，SIRT1可調控機體和組織內MMPs和TIMPs的表達[35-36]，而MMPs 和TIMPs 正是與組織纖維化密切相關的ECM代謝最為關鍵的酶系。非感染性炎癥時NF-κB與TGF-β1在組織中異常表達，從而導致纖維化進展。SIRT1能抑制脂肪酸介導的非感染性炎癥以及炎癥相關細胞因子的表達[37]。用SIRT1激活劑resveratrol處理的細胞可以增加SIRT1與cIAP的結合，最終的效應是使其不再被NF-κB激活，從而減輕炎癥因子等導致組織纖維化的程度，保護組織器官功能正常[38]。

此外，SIRT1可以直接作用于組蛋白H4K16、H3K9和H1K26等使賴氨酸去乙酰化，從而促進染色質的靜默而抑制其轉錄活性。去乙酰化作用導致組蛋白乙酰化程度降低，而組蛋白乙酰化與甲基化過程又常常相互轉化，因此SIRT1去乙酰化作用導致甲基化作用改變，從而降低組蛋白H3K9的甲基化程度。組蛋白H3K9甲基化是基因轉錄沉默的標志[39]。SIRT1作用于H3K9甲基化催化酶所在的區域，從而影響組蛋白H3K9的甲基化，進而抑制相關基因轉錄達到影響NF-κB細胞信號的激活[40]。因此上述研究不但從多個角度證實，SIRT1通過抑制NF-κB的活性達到調控NF-κB介導的纖維化相關效應，而且也證實SIRT1可以調控ECM代謝。提示基于SIRT1進而調控NF-κB表達，從而達到延緩纖維化病變進程是可行的。

2.3 中醫藥對SIRTs/NF-κB信號通路的調控作用

本研究發現，QGYS延緩腎臟纖維化的作用與PI3K/Akt密切相關。QGYS及黃芪等藥物干預可以顯著下調TGF-β1在UUO小鼠腎組織上的表達水平。QGYS和黃芪單味藥均可以減輕UUO小鼠腎小管病變。研究表明，NF-κB及IκB在QGYS和黃芪單藥的腎組織中低表達，2組效果均優于西藥洛丁新，且QGYS優于黃芪單藥，體現了中醫復方中藥物相互配合、作用全面的特點及優勢。QGYS可以緩解UUO小鼠腎臟EMT的程度，減輕ECM異常積聚，從而延緩腎臟纖維化進展，從分子生物學角度驗證了該結論的可靠性。課題組在另一個研究證實，QGYS可以明顯抑制阿霉素腎病大鼠腎臟纖維化的病變過程，其作用機制同樣是多靶點作用，療效與減少尿蛋白漏出，降低尿NAG酶水平，抑制腎臟ECM積聚，改變TGF-β1、TIMP-1和MMP-2在腎臟皮質的表達，從而有利于降解ECM。進一步研究發現，這些作用的實質與NF-κB/TGF-β1/Smad調控密切相關，因此QGYS基于NF-κB對ECM的調控具有其合理性[41-42]。結合SIRTs與NF-κB之間的密切關系，特別是SIRT1等對于NF-κB的調控作用，在研究中進一步證實兩者之間關系密切，相關體內外實驗研究工作已基本完成，論文尚未發表。

綜上， NF-κB在CKD病變過程被激活并受各種因素影響下作用增強，激活的NF-κB與TGF-β/smads等細胞信號協同作用影響腎臟纖維化的進程[43]。借助表觀遺傳學研究認識到，通過SIRTs蛋白的調控可以影響NF-κB表達，進而影響TGF-β/smads等細胞信號通路相關基因表達作用，為探討腎臟纖維化病變關鍵靶點提供了方向。因此，通過調節SIRT1的表達進而影響NF-κB和TGF-β/smads等信號通路相關細胞因子表達、基因轉錄、基因翻譯和細胞周期蛋白表達，從而減輕腎臟纖維化[9]的研究思路具有可行性。

3 中醫學對慢性腎臟病的認識

從中醫學角度探討CKD病變的始動因素是腎氣虧虛，病機關鍵則是脾腎兩虛和血脈瘀阻。人體臟腑功能正常、氣血充盈流暢則外邪難以入侵，內邪難以產生，就不會發生疾病。故《素問遺篇·刺法論》說：“正氣存內，邪不可干。”而當人體臟腑功能失調、正氣相對虛弱、衛外不固，或人體陰陽失衡、病邪內生，均可使人體臟腑組織經絡官竅功能紊亂從而發生疾病。《素問·評熱病論》說：“邪之所湊，其氣必虛。”《靈樞·口問》說：“故邪之所在，皆為不足。”《靈樞·百病始生》也說：“此必因虛邪之風，與其身形，兩虛相得，乃客其形。”《素問·生氣通天論》所謂“陰平陽秘，精神乃治”就是指人體陰陽動態平衡為關鍵，而CKD正是陰陽失調為病。腎中陰精是一身精氣血化生的源泉，腎中陽氣是功能活動的原動力。腎中陽氣是元氣所化生，是生命活動的根本。CKD多表現為腎中陽氣受損，腎臟不能發揮氣化溫煦作用，輕則水液代謝異常，重則水毒傷及臟腑引起變證百出而危及生命。正如《素問·逆調論》所論“腎者水臟，主津液”“諸病水液，澄沏清冷，皆屬于寒”和“諸寒收引，皆屬于腎”的觀點。CKD發展到一定程度往往伴有血脈瘀阻的證候，也就是說，一方面不能閉藏精氣，脾腎俱虛導致精氣外泄；另一方面氣血失和導致氣不帥血則血脈運行不利。血脈運行不利則引起脈絡閉阻而致病變深入，所以血脈瘀阻往往貫穿于CKD始終。

從中醫學角度而言，正氣虧虛必將導致血液失去動力而瘀阻，血脈瘀阻也會導致臟腑功能失常影響正氣生成，兩者相互影響。從現代醫學而言，腎小球本身血脈豐富且細小，易于受到各種病因作用導致血脈瘀阻和腎小球功能下降，以致腎臟功能損傷進行性加重。因此從中醫學角度而言，“正氣虧虛”和“血脈瘀阻”是CKD發病的核心病因。從現代醫學而言，腎臟纖維化導致CKD病變進展是其核心病理。應用中醫藥治療CKD的主要目的就是應對“正氣虧虛”和“血脈瘀阻”，達到阻止CKD病變進展的作用。前一章節的論述證實，SIRTs和NF-κB水平與腎臟纖維化密切相關，因此對于SIRTs和NF-κB調控必將對于CKD的防治起到重要作用。中藥及其活性成分可以有效地調控SIRTs家族在體內的表達水平，進而調控NF-κB表達，從而達到調控ECM在組織間的積聚，發揮腎臟的保護作用[7]。

中醫藥對慢性腎病的治療是通過SIRTs/NF-κB信號通路的調控影響而發揮作用，主要是通過對SIRTs和NF-κB水平的調控，影響腎臟纖維化相關的細胞因子TGF-β和細胞外基質相關的代謝酶，從而達到延緩腎臟纖維化達到治療CKD的目的。中醫藥對于SIRTs和NF-κB的調控發揮作用，不僅僅是由于中醫藥對相關細胞信號通路關鍵細胞因子的調控作用，同時也是對CKD多個重要分子生物學病變機制的多靶點治療作用，體現了中醫藥研究從宏觀到微觀、從整體到局部、從干預到改變的認識方法和治療思路。

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