慢性丙肝患者高通量測序TCR-CDR3免疫組庫研究

張園海，葛國洪，陶 艷，邵江波，吳 迪

（江蘇大學附屬鎮江三院肝炎科，江蘇 鎮江 212000）

目前據世衛組織統計，全球感染HCV人群約有1.85億，55～85%成為慢性丙肝，部分人群發展為肝硬化及原發性肝癌。每年死于HCV感染相關病例約35萬例。丙肝的發病機制可能與宿主感染HCV后引起的T淋巴細胞免疫反應有關[1,2]。每一種特異的T淋巴細胞表面表達一種特異性的T淋巴細胞抗體（TCR），識別抗原和介導免疫應答。TCRβ基因可變區有三個互補決定區（CDR），其中CDR3是其主要決定區。故研究CDR3序列的特異性與多樣性對于識別TCR具有重要意義[3-5]。本研究利用高通量測序技術來研究分析慢性丙肝患者外周血中TCR-CDR3免疫組庫特性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我院收治的慢性丙肝患者6例血液標本，均來自我院門診患者，診斷均符合2000年病毒性肝炎防治方案。入選時排除合并甲肝、乙肝、戊肝以及HIV等感染，排除自身免疫性疾病、酒精性肝病、脂肪肝、血吸蟲肝病、惡性腫瘤等。所有入選病例均未進行抗病毒治療。

1.2 T淋巴細胞分離并提取RNA

取各研究對象血液標本10 mL，采用Ficoll密度梯度離心法分離出外周血單個核細胞，用免疫磁珠分離法去除B細胞、NK細胞（INVITROGEN Dynabeads?Untouched? Human T Cells試劑盒）。分離得到的T細胞（細胞數量約為1 X 106）立即提取RNA。

cDNA一鏈的合成，進行多重PCR擴增：提純總RNA后，合成cDNA一鏈（TOYOΒO的ReverTra Ace -α-TM試劑盒）。進行5 min 95度活化熱啟動，30秒95度變性，60度退火90秒，72度延伸90秒，反復循環35個，再予68度末次延伸。Βioannalyzer分析產物質量。擴增產物可放置2～8°C過夜，然后放置于–20°C長期保存。

2 結 果

2.1 慢性丙肝患者TCR-CDR3免疫組庫的建立

收集慢性丙肝病例6例（具體資料見表1）運用Illumina Miseq測序平臺測序，得到6例HCV患者外周CD4T細胞共1683286個TCRβV基因CDR3序列，建立HCV患者外周血TCR-CDR3免疫組庫。去除冗余后的氨基酸序列，得到CDR3 有效序列151246個。6例患者其CDR3序列數385787～215883。去除冗余氨基酸序列，得到有效序列在33936～17271。

表1 入選慢性丙肝患者一般資料

2.2 各樣本V區、J區基因使用頻率分布

入選的6名HCV感染病例，其CDR3序列氨基酸長度，主要為11（25.5%），12（24.17%），13（16.33%），其次為10（9.5%），14（7.5%），類似于正態分布，符合正常個體的CDR3長度分布。TCRβ鏈的V區基因共59個亞型，使用頻率分布，TRBV-2（18.83%），TRBV-15（12.17%），TRBV-19（11.17%），TRBV-30（7.33%），TRBV29-1（4.5%），TRBV5-1（4.0%）。（見圖1）TCRβ鏈的J區基因共14個亞型，其使用頻率分布，主要為TRBJ1-1（24.33%），TRBJ2-7（18.33%），TRBJ2-3（11%），TRBJ2-5（9%），TRBJ1-2（8%），TRBJ2-1（7.83%），TRBJ2-2（6.5%），TRBJ1-4（5.33%），TRBJ1-5（4.67%）。（見圖2）

圖1 TCRβ鏈的V區基因使用頻率分布

圖2 TCRβ鏈的J區基因使用頻率分布

2.3 各樣本V區-J區基因結合情況分布

將6個樣本的TCRβ鏈的CDR3受體庫，V-J基因取用配對情況分析顯示：各樣本均存在高頻配對TRBJ1-1–TRBV19，6號樣本（4%）、5號樣本（1%）、3號樣本（8%）、4號樣本（2.5%）、1號樣本（3%）、2號樣本（5%）。，其均值為3.92%。同時也存在高頻配對TRBJ1-1–TRBV2，6號樣本（2%）、5號樣本（1%）、號樣本3（5%）、4號樣本（3%）、1號樣本（3%）、2號樣本（5%），其均值為3.17%。在統計學上，將其用皮爾森相關系數分析得r=0.83。見表2。

表26個樣本V區-J區基因結合情況分布

3 討 論

HCV感染易慢性化，導致肝硬化、原發性肝癌。其與宿主免疫、遺傳易感性、以及病毒分型等有關，慢性丙肝既是一種病毒感染性疾病，也是一種免疫性疾病。其中HCV特異性T淋巴細胞免疫在決定患者感染結局方面起主要作用，而體液免疫對其作用微弱[1,6]。

TCR是T淋巴細胞表面的特異性識別抗原分子，介導免疫應答。外周血中T細胞主要為TCRα/β的T細胞，是介導免疫應答的反應的主要細胞。其中CDR3為主要高變區，由V、D、J進行重排，促成了其多樣性[7,8]。

本研究中，采用Illumina Miseq高通量測序平臺對6例HCV感染患者CDR3進行測序，分析其V區、J區免疫學特征。研究觀察到，6例HCV患者TCRCDR3有效序列多的達385787，少的有215883個，其個體差異大。TCRβ鏈的V區基因使用頻率分布最高的前3位是TRBV-2（18.83%），TRBV-15（12.17%），TRBV-19（11.17%）。TCRβ鏈的J區基因使用頻率分布最高的3位，主要為TRBJ1-1（24.33%），TRBJ2-7（18.33%），TRBJ2-3（11%），TRBJ2-5（9%）。將其V-J基因取用配對情況分析可見，5號樣本配對比例最高的是TRBJ1-1–TRBV29-1（16%），而在6號樣本卻連0.5%都不到。2號樣本最多的TRBJ2-3–TRBV15（14%），在6號樣本中達12%，但在其他4個樣本中均不到0.05%。提示各樣本均有其個體差異[9，10]。觀察比較各樣本，僅在TRBJ1-1–TRBV19（3.92%），TRBJ1-1–TRBV2（3.17%），6個樣本具有一致性，均存在高頻配對一致性。在統計學上，將其用皮爾森相關系數分析得r=0.83，具有正相關。推測其TRBJ1-1–TRBV19、TRBJ1-1–TRBV2可能參與HCV感染的發病、免疫應答等[11]。但本研究病例有限，仍需擴大研究病例證實。

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