多肽體內外肺癌靶向性鑒定研究

張正兵，臧林泉*

（1.漳州衛生職業學院，福建 漳州 363000；2.廣東藥科大學，廣東 廣州 510006）

惡性腫瘤將是21世紀人類的“頭號殺手”，2014年世界衛生組織預測，到2025年全球癌癥新發病人數將達到1900萬，而我國2015年新增癌癥病例達到429萬，占全球癌癥病例數的首位[1-2]。目前惡性腫瘤的藥物治療主要還是依靠傳統的細胞毒類藥物進行臨床化療，給惡性腫瘤病人帶來嚴重的不良反應。小分子多肽具有分子量小、靶向性強、活性高、毒性弱、易于穿膜吸收等特點，在腫瘤靶向性研究領域特別是造影劑、腫瘤靶向性前體藥物的開發和研究中具有重要的意義[3]。近年研究較為熱門的是多肽作為靶向給藥載體的研究，特別是以整合素為受體的相關配體作為載體的研究。迄今為止，出現了許多以整合素為受體的抗血管生成的療法，其中包括有多肽、抗體、小分子干擾核糖核酸（siRNA）以及聯合用藥的靶向給藥等[4]。

1 材料與儀器

1.1 主要試劑和儀器

熒光倒置顯微鏡（德國Leica）；V7型快速混勻器（美國Essenscien公司）；獨立送回風凈化籠具（IVC）（蘇州市蘇杭實驗動物設備廠）；AUY120型電子天平（日本島津公司）；多肽FITC-Peptide1-10號（課題組設計，北京中科亞光多肽公司合成）；多聚甲醛（北京鼎國生物有限公司），OTC冷凍切片包埋液（北京鼎國生物有限公司），免疫組化專用載波片（廣州瑞舒生物有限公司）。

1.2 實驗動物

健康裸鼠，約4周齡左右，雌雄各半，體重在18～22 g，購置于中山大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（粵）2011-0029。

1.3 標本

人肺腺癌細胞系NCI-H1299，購自中科院上海細胞所；肺癌組織芯片，購自桂林泛譜生物技術有限公司，批號LUC1501。

2 實驗方法

2.1 FITC標記多肽在荷瘤裸鼠體內組織分布

以尾靜脈注射方式將2mg/mL FITC標記的多肽（1-10號）注入裸鼠體內，500 μL/只，同時以FITC作為陰性對照，10 min后乙醚麻醉裸鼠，橫隔水平切開皮膚，暴露全部胸壁，小心剪斷胸骨，避免損傷心臟和腫瘤供血血管；充分暴露心臟后，通過左心室用靜脈針穿刺入主動脈，同時在右心耳處剪開一小口，緩慢推注生理鹽水進行灌流，直至流出的血液變成淡紅色為止。換用4%多聚甲醛灌流，40%蔗糖脫水，待裸鼠肢體變硬即可，立刻取裸鼠皮下的瘤塊，OTC包埋后制備冰凍切片（10 μm），熒光倒置顯微鏡下觀察熒光強度并拍照。

2.2 FITC標記多肽的組織免疫熒光化學鑒定

取人肺癌組織芯片（LUC1501）于60℃烘箱中固定30 min，取出后按以下步驟脫蠟。脫蠟步驟如下：將組織芯片按順序浸泡于以下溶液中：二甲苯30 min、二甲苯10 min、100%乙醇10 min、90%乙醇10 min、80%乙醇10 min、70%乙醇10 min、50%乙醇10 min，在恒溫搖床上用PBS洗3次，5 min/次。抗原修復，采用晶芯微陣列芯片掃描儀對組織芯片的熒光進行掃描分析。以單獨FITC作為陰性對照，重復三次實驗，統計陽性率、假陽性率。

3 結 果

3.1 FITC標記多肽（1-10）在荷瘤裸鼠體內組織分布

結果顯示，在10條備選多肽中，3號多肽和7號多肽對肺癌NCI-H1299體內移植瘤組織具有較高的親和力和特異性，直接反應在熒光強度上較其他條肽高。3號肽和7號肽主要濃集于裸鼠腫瘤組織中，呈明亮的綠色熒光，結果見圖1。

圖1 FITC標記多肽（1-10號）在肺癌NCI-H1299裸鼠腫瘤組織分布情況（100×）

圖2 FITC標記多肽與人肺癌組織芯片的免疫熒光鑒定，圖中紅色框內為正常組織，藍色框內為肺炎組織，黃色框內為記號點，其余組織為各類型肺癌組織

3.2 FITC標記多肽的組織免疫熒光化學鑒定

實驗結果見圖2所示，芯片包括70例不同類型肺癌組織，5例正常及炎癥等組織。肺癌組織主要是肺鱗癌組織，肺腺癌組織，肺腺鱗癌組織，肺泡癌組織，乳頭狀腺癌組織，以及轉移癌組織等。本實驗中沒有出現脫片現象，以熒光強度＞2倍肺炎和正常組織熒光強度為陽性，三張芯片取平均值統計陽性率和假陽性率，同時以單獨FITC作為陰性對照，對1-10號FITC標記多肽的靶向性情況進行統計。

統計結果顯示，1-10號多肽對肺癌診斷的陽性率分別為27.3%、28.2%、32.1%、21.4%、10.7%、18.2%、28.4%、19.3%、13.6%、12.9%，而FITC的陽性率為1.43%。結果表明，3號多肽和7號多肽的陽性率較其他條多肽高，表明3號肽和7號肽與肺癌各個組織的結合率高。3號多肽的陽性率最高，但是有20%的假陽性率，而7號多肽雖在陽性率28.4%較3號肽32.1%低，但是假陽性率為0%。實驗結果提示3號肽和7號肽均可用于后續的實驗。見表1。

表1 FITC標記多肽與人肺癌組織芯片的免疫熒光統計結果（n=3）

4 結 語

目前國內外開發的以RGD為配體的靶向腫瘤血管的藥物已屢有報道，整合素配體—藥物復合物以及以整合素配體為靶向的藥物小分子探針多有研究[5-6]，例如含有RGD（Arg-Gly-Asp）序列的環狀5肽西侖吉肽，用于靶向性治療非小細胞肺癌、胰腺癌和肉瘤等實體瘤。

本實驗待篩選的多肽基于RGD肽設計而來，從組織切片實驗中發現3號和7號多肽在荷瘤裸鼠肺癌移植瘤組織中具有較強的熒光分布，提示待篩選多肽與整合素受體可能有較高的親和力。組織芯片鑒定結果顯示3號肽和7號肽具有較高的陽性結合率，但3號肽同時也伴有20%的假陽性率，而研究表明惡性腫瘤的發生和發展常伴有前期炎癥的產生，腫瘤本身在生長的過程中隨著體積的增大，內部腫瘤細胞血流量減少，提供的營養物質不足以支撐其生長所必需的能量要求，內部細胞出現化膿炎癥等現象，伴隨著炎癥的產生的，并通過特異性的信號轉導通路進一步促進或誘導腫瘤的發生[7-8]。通過體內組織切片和體外組織芯片鑒定結果提示，3號多肽和7號多肽具有靶向性結合肺癌組織的作用，未來在靶向性抗肺癌新藥研究中具有重要的意義。

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