血小板型12-脂氧合酶促進(jìn)小鼠上皮細(xì)胞JB6 P+的增殖

周 婷，王 瑩，喬 丹，樸英實(shí)*

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究中心，吉林 延吉 133002）

血小板型12-脂氧合酶（Platelet 12- lipoxygenase,p12-LOX）是脂氧合酶家族中重要的一員[1]，并在結(jié)腸癌、肝癌、卵巢癌等腫瘤組織中高表達(dá)[2]。研究表明，p12-LOX在腫瘤中的高表達(dá)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有密切相關(guān)，主要通過(guò)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞增殖發(fā)揮重要作用。p12-LOX的選擇性抑制劑黃芩素（Baicalein,BAI）取自黃芩根部，具有抗炎、抗氧化、抗病毒的作用，且通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡、阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期發(fā)揮著抗腫瘤的作用[1]，還是一種理想的抗腫瘤藥物。小鼠上皮JB6 P+細(xì)胞來(lái)源于JB6 P-細(xì)胞，并在腫瘤刺激物的作用下轉(zhuǎn)化為啟動(dòng)化的細(xì)胞，具有癌前病變的特性。本文著力于研究p12-LOX及其選擇性抑制劑BAI對(duì)小鼠上皮JB6 P+細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察

小鼠上皮JB6 P-細(xì)胞和JB6 P+細(xì)胞來(lái)自于美國(guó)模式菌種保藏中心，細(xì)胞培養(yǎng)于含有5%胎牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，并放置在5%CO2和37℃的恒溫箱中。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription PCR，RT-PCR）

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用TRIzol試劑提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄酶Superscript III將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA為模板用RT-PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下：p12-LOX，上游序列5’-GCGGTCTTCGAATTGAACTT-3’和下游序列5’-CAGGAACAGTGTTGGAGCTG-3’；β-actin：上游序列5’- GAAGAGCTAC GAGCTGCCTGA-3’和下游序列5’- CAGACAGCACTGTGTTGGCG-3’。取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.3 MTT（噻唑藍(lán)）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的JB6 P+細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔102和103個(gè)細(xì)胞并過(guò)夜培養(yǎng)，次日每孔加入0.2 L的5 mmol/L的BAI處理細(xì)胞（BAI組），對(duì)照組加入同等體積的二甲基亞砜（DMSO），每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)細(xì)胞4天、6天時(shí)每孔加入10 L的5 mg/mL的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，形成的藍(lán)色甲瓚結(jié)晶用DMSO溶液溶解（每孔加入100 L），用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm的吸光度值（OD）并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）=實(shí)驗(yàn)組OD/空白對(duì)照組OD×100%。

1.4 單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的JB6 P+細(xì)胞常規(guī)消化并制備成10個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液，并100 L細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使每孔有一個(gè)細(xì)胞，用0 mol/L和5 mol/L的BAI分別處理細(xì)胞14天，克隆形成后用Gimsa染色液進(jìn)行染色并計(jì)算克隆形成率。克隆形成率（%）=單克隆形成數(shù)目/96×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)中所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次。采用SPSS17.0和GraphPad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示；多組間數(shù)據(jù)的比較采用方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LDS-t檢驗(yàn)；2個(gè)獨(dú)立樣本間的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡下JB6 P+細(xì)胞間連接松散

鏡下JB6 P-細(xì)胞與細(xì)胞連接緊密呈柵欄狀，而JB6 P+細(xì)胞與細(xì)胞間連接松散，無(wú)規(guī)律且有擴(kuò)散趨勢(shì)。見(jiàn)圖1A。

2.2 JB6 P+細(xì)胞中的p12-LOX mRNA表達(dá)高于JB6 P-細(xì)胞

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，p12-LOX的mRNA水平在JB6 P-細(xì)胞中微弱，而在JB6 P+細(xì)胞中的表達(dá)強(qiáng)烈，明顯高于JB6 P-細(xì)胞中的表達(dá)。見(jiàn)圖1B。

2.3 p12-LOX選擇性抑制劑BAI抑制細(xì)胞增殖

MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BAI可顯著抑制JB6 P+細(xì)胞的增殖（均P＜0.01），在10*3個(gè)細(xì)胞/孔密度時(shí)的增殖率分別為第4天時(shí)54.24%±2.67和第6天時(shí)70.27%±3.62，而在10*2個(gè)細(xì)胞/孔密度時(shí)的增殖率分別為第4天時(shí)8.91%±0.34和第6天時(shí)2.28%±0.17，在細(xì)胞密度低的條件下BAI對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率更為顯著。見(jiàn)表1。

2.4 BAI抑制JB6 P+細(xì)胞的單細(xì)胞克隆形成

單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組的單細(xì)胞克隆形成率為53.82%±4.92，而5mol/L的BAI組為2.08%±1.80，BAI顯著抑制了JB6 P+細(xì)胞的單細(xì)胞克隆形成（P＜0.01）。見(jiàn)圖2。

表1 BAI對(duì)JB6 P+細(xì)胞增增殖率的影響（x±s）

3 討 論

p12-LOX在多種癌組織中高表達(dá)，可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞存活、和促進(jìn)血管生成促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，而B(niǎo)AI作為p12-LOX的選擇性抑制劑可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，5～50 mol/L的BAI處理胃癌MGC-803細(xì)胞可使凋亡小體增加，說(shuō)明BAI誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖。胃癌MKN-28細(xì)胞中p12-LOX mRNA呈高表達(dá)，用25～100 mol/L的BAI處理細(xì)胞可呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性地抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果也表明，JB6 P+細(xì)胞中p12-LOX的mRNA表達(dá)水平高于JB6 P-細(xì)胞中的表達(dá)，BAI可顯著抑制JB6 P+細(xì)胞的增殖和單細(xì)胞克隆形成，尤其在細(xì)胞密度減少到10*2時(shí)。這些結(jié)果表明，p12-LOX對(duì)小鼠上皮JB6 P+細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，尤其對(duì)低密度細(xì)胞的增殖具有重要的作用。

綜上所述，p12-LOX具有促進(jìn)小鼠上皮JB6 P+細(xì)胞增殖的作用，尤其促進(jìn)單個(gè)或低密度細(xì)胞的增殖。

[1] 金京春,葉 晶,蔡洙哲.血小板型12-LOX抑制劑黃芩素抑制胃癌MK-28細(xì)胞增殖和遷移[J].腫瘤,2016,36(2):173-180.

[2] Klampfl T,Bogner E,Bednar W,et al.Up-regulation of 12(S)-lipoxygenase induces a migratory phenotype in colorectal cancer cells[J].Exp Cell Res,2012,318(6):768-778.