TRPC6、α-actinin-4在阿霉素腎病大鼠腎組織的表達(dá)差異及意義

杜 宇，史應(yīng)進(jìn)，張艷輝，賈妮亞，范俊英，王彩麗*

（包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010）

足細(xì)胞是維持腎小球基底膜（GBM）結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細(xì)胞之一。而TRPC6、α-actinin-4又是維持足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能的主要蛋白，因?yàn)樽慵?xì)胞不可再生的特性，它的損傷導(dǎo)致并增加了蛋白尿的發(fā)生[1]，進(jìn)一步加劇腎小球的硬化，。阿霉素有非常強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用，可以直接對(duì)腎細(xì)胞產(chǎn)生損傷，其機(jī)制可能是從DNA水平干預(yù)了足突細(xì)胞蛋白的合成，從而破壞足突細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，改變了足突細(xì)胞形態(tài)[2]。因此目前被公認(rèn)的能較好模擬人類腎小球疾病的動(dòng)物模型就是阿霉素腎病大鼠模型，該模型的病理類型為微小病變（MCD）和局灶節(jié)段性腎小球硬化（FSGS）。本文通過(guò)分析TRPC6、α-actinin-4在大鼠正常腎組織和阿霉素腎病大鼠不同病理類型腎組織的表達(dá)差異，以探討該分子在蛋白尿發(fā)生中的可能作用及相互關(guān)系。

1 材料余方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠30只，體重200 g左右（內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCX（蒙）2002-0001）。鹽酸阿霉素（山西普德制藥10 mg/支）。兔抗鼠α-actinin-4多克隆抗體：兔抗鼠TRPC6多克隆抗體（濃縮型）100 ug/mL MAB1682美國(guó)Chemicon公司。SP試劑盒（北京博奧森）。DAB顯色系統(tǒng)（福州邁新）。

1.2 模型建立及分組

實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨即分為3組：正常對(duì)照組（n=10）、微小病變組（MCD組，n=10）、局灶節(jié)段性腎小球硬化組（FSGS組，n=10）。MCD組測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，在非麻醉狀態(tài)下尾靜脈一次性注射鹽酸阿霉素7.5 mg/kg，并于注射后第7天和第14天分別測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，第14天處死對(duì)大鼠的腎組織制備成蠟塊備用。FSGS組大鼠測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，在非麻醉狀態(tài)下第7天尾靜脈注射阿霉素5 mg/kg，第14天尾靜脈注射阿霉素2.5 mg/kg，注射后28天和56天分別測(cè)定24小時(shí)尿蛋白定量、血清白蛋白、總膽固醇、肌酐，第56天處死對(duì)大鼠的腎組織制備成蠟塊備用。

1.3 免疫組化

石蠟切片脫蠟水化，采用SP法免疫組化試劑盒，檢測(cè)TRPC6、α-actinin-4。

1.4 影響采集

用Olympus DP72攝象頭及DP-BSW采集圖像，利用Image Pro Plus 6.0（IPP6.0）圖像分析軟件，分別測(cè)定每個(gè)腎小球中TRPC6、α-actinin-4陽(yáng)性面積占其整個(gè)腎小球面積的比。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間的比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料以“±s”表示。

2 結(jié) 果

2.1 TRPC6

TRPC6在微小病變表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增多（P＜0.01），在局灶節(jié)段性腎小球硬化腎小球內(nèi)的的表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增多（P＜0.01），TRPC6在局灶節(jié)段性腎小球硬化組中增多較微小病變組更加顯著（P＜0.01）。

表1 TRPC6在不同病理類型大鼠腎小球的表達(dá)對(duì)比（n，%）

2.2 α-actinin-4

α-actinin-4在微小病變組表達(dá)增加（P＜0.01），而在局灶節(jié)段性腎小球硬化組表達(dá)與對(duì)照組無(wú)明顯差異。見(jiàn)表2。

表2 α-actinin-4在不同病理類型大鼠腎小球的表達(dá)對(duì)比（n，%）

2.3 TRPC6，α-actinin-4的表達(dá)

對(duì)照組TRPC6，α-actinin-4兩者的表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05），而腎小球內(nèi)者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R=-0.633，P＜0.01），隨著TRPC6的表達(dá)增加，α-actinin-4的表達(dá)減弱。見(jiàn)表3、圖1。

表3 TRPC6、α-actinin-4的表達(dá)相關(guān)性

圖1 TRPC6與α-actinin-4表達(dá)相關(guān)趨勢(shì)圖

3 討 論

足細(xì)胞是一種增殖能力及其有限的終末分化細(xì)胞，具有穩(wěn)定的表型[3]，它是維持GBM結(jié)構(gòu)和功能正常的主要細(xì)胞之一。因?yàn)樽慵?xì)胞不可再生的特性，它的損傷導(dǎo)致并增加了蛋白尿的發(fā)生[4]，進(jìn)一步加劇腎小球的硬化[5-6]。

足細(xì)胞正常功能及結(jié)構(gòu)需要幾個(gè)主要蛋白的相互作用[7]，而當(dāng)足細(xì)胞受損時(shí)，足細(xì)胞的足突間裂孔隔膜（SD）功能和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，這些主要結(jié)構(gòu)蛋白的改變引起了其結(jié)構(gòu)以及功能失調(diào)，從而造成腎小球足細(xì)胞的功能和結(jié)構(gòu)的改變，蛋白從改變的足細(xì)胞中漏出引起了蛋白尿。進(jìn)一步的研究顯示[8-9]，TRPC6編碼的蛋白與足細(xì)胞的骨架蛋白actin（肌動(dòng)蛋白）有著非常緊密的聯(lián)系。在體外培養(yǎng)成熟的足細(xì)胞，當(dāng)其發(fā)生TRPC6蛋白的過(guò)度表達(dá)，actin纖維就會(huì)發(fā)生大量的解聚，從而使裂孔隔膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。TRPC6基因突變可使足細(xì)胞內(nèi)鈣離子增加從而引起增殖減少、細(xì)胞凋亡進(jìn)而減少足細(xì)胞的數(shù)量。

目前關(guān)于TRPC6，α-actinin-4的相關(guān)性研究還很少，國(guó)外未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，國(guó)內(nèi)僅孫希峰[10]等做過(guò)兩者的相關(guān)性研究。本研究顯示，在對(duì)照組TRPC6，α-actinin-4兩者的表達(dá)無(wú)差異（P＞0.05），而發(fā)生病變的腎小球內(nèi)兩者的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（R=-0.633，P＜0.01）隨著TRPC6的表達(dá)增加α-actinin-4的表達(dá)減弱，與孫希峰等人的研究結(jié)果相似，這可能與TRPC6高表達(dá)通過(guò)使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高、直接影響肌動(dòng)蛋白支架以及組成機(jī)械敏感性鈣離子通道引起足細(xì)胞的損傷和脫落，致使足細(xì)胞數(shù)量減少，而α-actinin-4做為足細(xì)胞的骨架蛋白從而表達(dá)數(shù)量減少以及TRPC6蛋白過(guò)度表達(dá)時(shí)，actin纖維大量解聚，裂孔隔膜結(jié)構(gòu)松散而導(dǎo)致α-actinin-4表達(dá)下降。

TRPC6與α-actinin-4作為重要的構(gòu)成足細(xì)胞蛋白分子其作用機(jī)制目前仍未背完全闡明，而探討不同病理類型兩者的表達(dá)差異進(jìn)一步探討TRPC6和α-actinin-4的相關(guān)性，以及其在足細(xì)胞損傷中的作用，希望給臨床診斷、治療效果及預(yù)后的判斷提供有價(jià)值、無(wú)創(chuàng)的工具。期望早期對(duì)TRPC6、α-actinin-4的活性進(jìn)行干預(yù)來(lái)減少對(duì)蛋白尿患者足細(xì)胞的損傷，延緩腎衰竭的進(jìn)展。

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