借助科研平臺開展基因工程實驗課教學改革探索與實踐

趙燕+黃麗華+張學文

摘要 基因工程實驗是基因工程課程教學的重要環節。本文基于對基因工程實驗教學內容的整合和優化，借助科研平臺優勢進行基因工程實驗教學改革探索與實踐，分析了教學改革成效與存在的不足，并提出相應建議，以期調動學生的學習興趣、培養學生的科研素質、提高基因工程實驗課程教學質量。

關鍵詞 科研平臺；基因工程；實驗課程；教學改革；成效；建議

中圖分類號 G642.0 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）24-0276-03

Exploration and Practice of Genetic Engineering Experiment Teaching Reform with Help of Scientific Research Platform

ZHAO Yan HUANG Li-hua ZHANG Xue-wen * LI Jian

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha Hunan 410128）

Abstract Genetic engineering experiment is an important part of genetic engineering course teaching.In this paper，based on the integration and optimization in genetic engineering experiment teaching content，exploration and practice of teaching reform of genetic engineering experiment was carried out with the advantage of scientific research platform，the results and shortcomings of the teaching reform were analyzed and the corresponding suggestions were put forward，so as to arouse the students′ interest in learning，cultivate the students′ scientific research quality and improve the teaching quality of the genetic engineering experiment course.

Key words scientific research platform；genetic engineering；experiment teaching；teaching reform；result；suggestion

以DNA重組技術為基礎的基因工程操作是當今分子生物學研究的關鍵技術，基因工程作為一門實踐性和技術操作性都很強的課程，已經成為國內外高校生物技術、生物科學、生物工程、生物信息學等生物科學類本科生的核心主干課程[1-3]。而基因工程實驗教學是基因工程課程教學的重要內容，課程教學的目標更著重于培養學生掌握基因操作的技術，具備基因操作的能力。

隨著功能基因組時代的研究成果日新月異、基因編輯等研究熱點和新技術的出現，對生物技術人才的培養也提出了更高更新的要求，這一現狀使得國內各高校都加強了對基因工程及其實驗課程的重視程度，不斷探索新的教學內容和方法[4-5]。在校級精品課程和實驗教學改革項目的支持下，經過幾年的探索和實踐，對基因工程的實驗教學內容加以優化，在設置課程實驗的基礎上，開設出連續性的綜合實驗，結合教學方法及教學組織形式上的改革，使基因工程實驗課程教學更有利于核心技能的學習和掌握，培養了學生的研究性學習能力，提高了基因工程實驗課程教學質量[6]，已取得階段性成效。

為適應基因工程技術飛速發展的形勢，合理構筑學生理論和實踐知識結構，使學生在有限的課時內掌握完整的基因工程實驗操作技能，在上述教學改革的基礎上，近3年借助于科研平臺建立成熟的擬南芥、煙草、煙草BY2細胞系等植物的轉基因技術體系。同時，依靠學校對本科生基因工程課程教學項目建設的支持，從2014年開始，嘗試將擬南芥、煙草、煙草BY2細胞系等模式植物的遺傳轉化引入本科生基因工程實驗教學項目，利用基因工程綜合實驗中構建的多個植物表達載體，完成一系列系統完整的轉基因操作實驗。目前，這個實踐項目已經實施了 3年，取得了可喜的成效，積累了可行性的經驗。

1 轉基因受體材料的選擇

在轉基因受體材料的選擇上，考慮學生對轉化結果鑒定的直觀性和時效性，分別選擇了3種植物材料：①擬南芥（Arabidopsis thaliana），為十字花科蕓苔屬草本植物，屬自花受粉植物，一個生活世代只需60 d左右，植株小、收獲的種子多，容易獲得各種代謝功能的缺陷型，可以在培養皿滅菌條件下進行相關性狀的篩選，其基因組小且基因高度純合，便于遺傳分析。②煙草（Nicotiana tabacum L.），是茄科一年生或有限多年生草本植物，作為最早用于植物組織培養及植株再生的模式植物，其繁殖系數大、抗病毒能力強、生長旺盛，非常適宜于開展遺傳轉化和瞬時表達實驗。③煙草BY2細胞（Nicotiana tabacum L.cv Bright Yellow 2，BY2）是生物學研究中非常重要且應用廣泛的模式植物細胞，該細胞系具有高度的同一性，并且生長迅速，容易獲得具有高度同周期性的細胞，1周內可以增加80～100倍，易于在實驗室內培養繁殖和進行轉基因實驗操作，且轉基因細胞團和懸浮培養細胞都較易得到，其轉化結果可通過熒光顯微鏡迅速觀察，便于轉基因結果分析。選擇上述3種材料進行外源基因的轉化操作，可以讓學生以3種不同形式的受體類型（擬南芥植株、煙草葉盤組織器官、煙草BY2細胞系），掌握不同的遺傳轉化方法，分析不同類型的轉化結果。endprint

2 教學改革探索與實踐

基因工程課程通常安排在本科第6個學期開設。此前學生已經完成了生物化學、細胞生物學、分子生物學和普通遺傳學等基礎專業課程的學習。

2.1 基因工程綜合實驗的設計思路

將教師科研項目中研究比較成熟的部分改造成符合實驗教學要求的綜合性實驗項目，以基因表達框為基礎，引入啟動子和報告基因2個元件，實驗內容從構建含有外源目的基因的重組表達載體開始，主要包括重組表達載體的構建、重組表達載體及空表達載體的轉化、菌落PCR及酶切鑒定、工程農桿菌的制備及受體材料的遺傳轉化、轉基因材料的篩選鑒定。

2.2 改革措施

前期的課程改革，對基因工程的實驗內容進行整合和優化，將20個學時的課程實驗和1.0～1.5周的綜合實驗設計成兩大板塊。一是上游操作包括目的基因的分離純化、載體的制備、重組分子的構建、篩選及檢測等。利用20個學時的課程實驗，使學生掌握大腸桿菌等細菌的培養、基因組DNA提取、瓊脂糖凝膠電泳、PCR 擴增目的基因、DNA的酶切與回收純化、目的基因與載體的連接、感受態細胞的制備與轉化等基礎的分子生物學實驗技術。二是下游板塊則在1.0～1.5周的綜合實驗期間與科研項目聯系起來，綜合為系統的、連貫的系列綜合性實驗。

2.3 典型案例

以模式植物擬南芥為例，具體過程如下。實驗使用2種啟動子的表達載體，一是組成型啟動子CaMV35S，二是參與花粉形成的調控并可在心皮進行異位表達的組織特異表達啟動子AtTPD1pro，報告基因為GUS（β-葡萄糖苷酸酶基因）。以pCAMBIA1301-35S：：GUS載體為基礎，學生利用所學的DNA重組操作技術，將AtTPD1pro啟動子替換掉組成型CaMV35S啟動子，最終可得到2個載體pCAMBIA1301-35S：：GUS、pCAMBIA1301-AtTPD1pro：：GUS，轉化根癌農桿菌制備遺傳轉化的工程菌。采用經典的浸花序法轉化模式植物擬南芥，實驗設置非轉基因材料對照和農桿菌空載對照。通過對轉基因T0代種子的篩選及轉基因植株的GUS基因組織化學染色鑒定，轉化pCAMBIA1301-35S：：GUS載體的轉基因植株在各組織器官均有不同程度的GUS活性表達，而轉pCAMBIA1301-AtTPD1pro：：GUS載體的轉基因植株只在其花器官的雄蕊中有GUS活性表達，學生通過肉眼或實體顯微鏡觀察材料的染色情況，可以非常直觀地判斷外源基因是否整合和表達成功，比較組成型啟動子35S和組織特異性啟動子AtTPD1pro在基因表達上的差異，讓學生直觀地了解并掌握基因表達框中各個元件的作用。

在此基礎上，還將教師科研中利用生長素響應原件（DR5）構建的pBI121-DR5：：GUS、pBI121-DR5（Ω）：：GUS等重組表達載體，通過農桿菌侵注（注射葉片）煙草葉片瞬時表達檢測法，將2個載體分別轉化煙草，2 d后切下侵染的葉盤進行GUS染色分析，學生發現pBI121-DR5：：GUS的轉化葉片有明顯的藍色印跡，pBI121-DR5（Ω）：：GUS的轉化葉片卻無藍色印跡，其原因是GUS基因原有的5′UTR被來源于煙草花葉病毒的5′端序列（Ω）替換，該實驗讓學生真正理解了mRNA的有效翻譯是真核細胞基因表達的關鍵步驟，即GUS的5′UTR序列在真核細胞中對mRNA翻譯起始的調控有重要作用，（Ω）序列即使是一種植物增強基因表達的常用原件，但如果該序列的插入破壞了原有基因的表達框架仍然不能有效提高GUS基因表達。同時，開發的煙草BY2細胞系的遺傳轉化也是綜合實驗中學生愿意選擇的一種重要的遺傳轉化方法。分泌載體蛋白SCAMP2（Secretory Carrier Membrane Protein 2）廣泛分布于細胞質膜及細胞內膜系統，具有組成型的特點，直接參與膜泡運輸及跨膜活動，因而可以作為膜泡運輸研究的合適標記。以分泌載體蛋白基因 SCAMP2與綠色熒光蛋白基因GFP融合構建重組表達載體，采用根癌農桿菌與煙草BY2 細胞系共培養轉化法進行遺傳轉化，通過對轉基因和非轉基因BY2細胞系的熒光顯微觀察，學生直觀地觀察到GFP在細胞核附近、細胞基質內、細胞質膜及2個細胞間隔的組成型表達，而非轉基因的對照材料在熒光顯微鏡下卻沒有GFP的激發。

上述3種類型的遺傳轉化實驗在實驗周同時開展，學生根據課前實驗設計的方案和興趣選擇不同的實驗轉化小組，為避免學生選擇實驗類型的不均衡，擔任課程的2位實驗教師負責協調，統籌合理安排每類實驗的人數，全班分成8～10個實驗小組，運用3種類型的重組表達載體轉化3種不同的受體材料。實驗總課時為1.0～1.5周，為了這一綜合實驗項目的順利開設，在生物學實驗中心專門為本科生建立了植物生長馴化室，加之已有的無菌操作室、組織培養室、顯微鏡觀察室等。3年來，共對2012級、2013級、2014級生物技術、生物工程、生物科學3個專業16個班約540名學生開設了這一綜合實驗。實驗操作時，每個實驗班27～30人，學生每3個人分成一組操作，轉基因材料的管理和培養、種子收集、轉基因陽性后代的篩選鑒定等操作均由課程任課教師全程跟蹤指導，學生以組為單位負責完成，形成了以學生為主體、教師為主導的實驗教學模式。實驗課程改革還與基因工程理論課課程教學方法改革的重點項目結合在一起，利用翻轉課堂教學模式帶領學生參觀與科研平臺的協作單位湖南省棉花科學研究所的轉基因棉花基地，開展現場課程教學，學生通過參觀資源圃，考察和調查轉基因抗蟲棉花田，了解了轉基因抗蟲棉的選育歷程以及目前在生產中的應用情況。現場教學以轉基因抗蟲棉為事例，以生產現場為教學場景，具有極為生動的教學效果，提高了學生的響應度和參與積極性。

3 教學改革成效

將教師科研材料引入本科生基因工程實驗教學，實施3 年來成效十分明顯。一是這種多形式開放性的教學模式極大地激發了學生的實驗興趣和學習熱情，通過實驗提高了學生的團隊意識和工作責任感，鍛煉了學生從事科研工作必須具備的基本素質，且增強了學生之間的友誼和班級的凝聚力。二是通過農桿菌介導的擬南芥浸花序法、農桿菌介導的侵注（葉片注射）煙草葉片瞬時表達檢測法、農桿菌與煙草BY2細胞系共培養轉化法等不同的遺傳轉化方式的綜合實驗，學生親身經歷從載體構建到質粒提取、受體準備、各種遺傳轉化方法的具體操作和轉基因表型鑒定等各個環節的實踐操作，使學生們對基因工程操作的完整流程了然于心，通過實踐加深了對理論課知識的認識和理解。三是轉基因煙草瞬時表達的檢測方法快速方便，鑒定直觀，當學生完成轉基因操作2 d后，即可通過GUS組織化學染色，鑒定轉基因材料的結果。通過實體顯微鏡下染色部位觀察的差異性，明確地比較組成型啟動子和組織特異性啟動子驅動基因表達的不同功能，使學生消除了對轉基因的神秘感，增強了學生從事基因工程操作的自信心。四是3種不同的遺傳轉化方法和轉基因后代表型鑒定操作相對簡便、成功率高、時間短、操作可行性強。3種轉化方法都是科研平臺已建立的非常成熟的轉化體系，實驗中通過教師和平臺研究生的指導，轉基因后代的陽性率均較高。endprint

4 教學改革存在的不足及建議

4.1 實驗方案的設計和選擇方面

實驗方案和技術路線是實驗實施的藍本，等實驗周開始再讓學生進行實驗設計，將會占用較多的實驗時數而影響實驗進程。因此，從上理論課和課程實驗課開始就著手安排學生通過課程的數字化教學平臺、微信教學平臺及網絡資源查找相關文獻資料，熟悉實驗目的、設計要求和實驗內容，學生以3人為1個實驗小組，利用課外時間進行實驗設計，2位任課教師和學生共同對每個實驗小組展示的實驗方案進行點評論證。通過實驗設計環節使學生在討論式的學習中有序梳理知識點，最終的實驗方案是經點評論證后的優化方案，每位同學對后續的綜合實驗內容有一個初步了解。

4.2 實驗實施與實驗課時的安排方面

實驗實施集中在1.0～1.5周的綜合實驗周，而植物遺傳轉化實驗完成后，轉基因材料的后續培養、成熟、收種及轉基因材料的最終鑒定，由于每個小組的材料各異，時間上無法統一，有些實驗在規定的時間內還無法完成。為解決這一矛盾，實行了包括周末在內的全天候開放實驗室的措施，學生利用課余時間完成后續工作，同時任課教師輪值在實驗室實時指導學生。雖然這種工作模式較繁瑣且占用了教師和學生的課余時間，但由于整個實驗過程都是學生在實施自己的設計方案，且綜合實驗內容的延展完成可以作為其畢業論文，因而學生利用業余時間完成實驗的積極性較高。綜合實驗全部完成后，教師召集全班同學集中總結，各抒己見，增強了學生做實驗的成就感、興趣和信心，激發了學生的學習主動性。

4.3 實驗過程的管理方面

連續性的綜合實驗因專業不同，每個班時間為1.0周或1.5周，耗時長，實驗材料多，實驗操作涉及植物生長室、組培室、無菌接種室、顯微鏡室、離心機室、凝膠成像室等多個專業儀器室和實驗室，給實驗教師的管理帶來一定難度。因此，在排課時與教務處協調，盡量不與其他課程沖突時間，實驗周期間全天候開放實驗室，課余時間任課教師輪值，保證實驗實施的有序進行。

4.4 實驗經費的支持方面

學院實驗中心是省重點實驗室，前期的課程教改建設已根據教學內容對儀器設備進行配套，添置了先進、實用的新設備，提高儀器檔次和自動化程度，為基因工程實驗課程的開設和實踐教學搭建了堅實的平臺。但新型實驗的開發和實施需要一定實驗經費的支持，原有的實驗經費不能滿足需求。因此，積極申報課程改革項目，引導和鼓勵學生申報大學生科創項目，同時爭取科研平臺的實驗材料支持，使經費缺口得到了較好的解決。

5 結語

總之，改革后的基因工程綜合實驗，讓學生親自參與實驗設計，將教師科研材料引入本科生實驗中，使學生非常直觀地理解掌握了基因工程的操作過程，激發了學生對科學研究的興趣，培養了學生良好的科研素質，訓練了學生嚴謹的實驗習慣，為其進一步深造打下了良好的基礎。多名考研成功的學生反映綜合性實驗的開展，使其對基因工程的實驗原理、技術操作流程有了深刻的理解和掌握，實驗技能得到了良好的訓練，使其在研究生面試時得到導師的深度認可。另外，在課程組教師指導下，近年有逾40名學生成功申請了國家級、省級、校級大學生創新研究項目的立項支持，其實驗結果發表研究論文逾10篇。教師的辛勤付出也得到學生的高度認可，在學校對教師的評教體系中學生對教師的評教獲得了全優。

經過近3年的探索和實踐，開發教師科研材料引入本科生基因工程實驗課教學取得了一定的成效，構建了一個課程教學和科研平臺相結合的課程教學模式和體系，也為培養具有創新能力、高素質的復合型人才做出了有益的嘗試。

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