BRCA1與Rad51的相互作用研究進展

吳妮妮，馬 麗，盧 奎,2*

(1.河南工業大學 化學化工與環境學院，鄭州 450001；2.鄭州工程技術學院 化工食品學院，鄭州 450044)

由于環境因素以及電離輻射等多方面的影響，使得生物體細胞的正常生長機制被打亂，從而誘使生物體細胞異常生長，導致發生癌變。1994年科學家們初次分離并獲得乳腺癌易感基因(BRCA基因)，發現BRCA基因中的BRCA1和BRCA2與癌癥緊密相關[1]。女性若攜帶BRCA突變基因，則患乳腺癌、卵巢癌的概率大大增加，除此之外，其他幾種器官也易發生癌變。而男性此種基因突變攜帶者也會患癌[2]，如患前列腺癌、乳腺癌等，但男性患癌概率遠低于女性。人的Rad51蛋白是維持基因組穩定性的重要物質，研究發現在某些癌變組織中檢測到細胞內Rad51蛋白的高度表達，這類細胞對于抗癌藥物尤其順鉑藥物的耐藥性明顯增強。這些研究結果從側面證明Rad51與腫瘤緊密相關[3-8]。

BRCA1參與DNA修復，在維持基因組穩定性方面起重要作用，可與多種DNA修復酶或重組蛋白發生作用，包括Rad51、Rad50/MRE11/NIBRIN復合物、Bloom解凍酶等[9]。研究發現BRCA1和Rad51可形成不同的DNA修復復合物和作用位點，改變DNA所處環境后，BRCA1仍可發揮修復作用，且在順鉑誘導下，BRCA1的羧基末端能夠與Rad51作用來對DNA損傷位點進行修復[9]。因此，目前研究重點可著手于確定用順鉑和電離輻射治療后BRCA1在Rad51病灶中的作用。

多肽-蛋白質通過關鍵靶點進行的相互作用[10]在生物體內中發揮著重要作用。因此，可以利用ZDOCK和RDOCK的分子對接措施，對BRCA1和Rad51相互作用進行研討[11]。

1 BRCA1基因

研究表明，抑癌基因的失活及原癌基因的活化與癌癥密切相關[12-14]。BRCA1是一種可以抑制癌癥產生的重要基因，其基因狀態在乳腺癌和卵巢癌臨床防治方面的應用已成為醫學界的研究熱點。BRCA1蛋白囊括了大量的細胞過程，包括DNA復制、細胞周期檢查點控制、細胞凋亡和染色質重塑等[14]。目前對于BRCA1的研究主要集中在它的RING 區[15-16]和BRCT區[17]，其他區域研究相對較少。從BRCA1 的結構特征來看，BRCA1能夠與Rad51、p53等多種蛋白結合，同時參與細胞周期的調控、DNA的修復和中心體的復制[18]，從而抑制腫瘤的產生。

一旦基因發生突變，會大幅度增加患癌風險，目前采取的降低癌癥死亡率的最主要手段仍是早發現、早診斷、早治療，這主要依賴于疾病的早期篩查。早期篩查主要對BRCA1基因的突變[19]進行檢測，檢測內容主要包括無義突變、剪切位點突變和移碼突變。

醫學上對BRCA1基因進行的基因突變性檢測，主要依賴于對PCR擴增基因片段進行篩查或者直接測序的手段。PCR擴增的主要方式有：PCR-SSCP-SEQ，PCR-DHPLC-SEQ和PCR-SEQ。國內主要利用PCR-測序法[4]檢測樣本中BRCA1的胚系突變，尋找更多的突變位點，擴大突變譜圖，以此達到對基因突變引發乳腺癌的臨床病理學特征進行更深入研究的目的。當前對BRCA1/BRCA2基因突變的預測最常用的是BRCA Pro模型。

2 Rad51蛋白

HsRad51與大腸桿菌RecA同源，通過HR來進行遺傳物質(DNA雙鏈斷裂)修復。要使Rad51發揮修復作用，需切除DSB末端的DNA與Rad51來形成突觸纖維前體[20]。在此基礎上，利用免疫組化二步法[21]，進行染色處理，得到的Rad51蛋白主要位于腫瘤細胞的細胞核內部或圍繞著細胞核。研究發現Rad51蛋白含量的多少與人體能否病變形成腫瘤密切相關[3-8]。目前，臨床上主要利用放射線或藥物損傷來破壞腫瘤細胞的DNA，從而使得細胞死亡達到治療腫瘤的目的。Rad51蛋白在生物體內過量表達時，會加速腫瘤細胞在體內的生長擴散甚至會加速癌細胞轉移，使得腫瘤細胞或癌細胞對放療和化療的抵抗力增加[22]。因此，如何有效降低卵巢癌、乳腺癌細胞對癌癥藥物的耐藥性[23-26]，需要從抑制 Rad51蛋白的過量表達這方面入手。

3 BRCA1與Rad51的相互作用

Vispé S等[11]報道，在BRCA1未發生堿基或堿基對的缺失或突變情況下，Rad51過表達的細胞在細胞周期的S/G2期對電離輻射具有抗性，這闡明了Rad51蛋白的表達量與癌癥的發生緊密聯系。在BRCA2堿基突變的狀況下，Antoniou等[27]對Rad51上的135G-C進行患癌風險研究，結果顯示，此種情況下Rad51CC純合子的患癌率顯著增加。Krupa等[28]對Rad51和XRCC3的多態性進行了研究，發現XRCC3的Thr241Met基因會增加癌癥局部轉移的風險，而Rad51的135G-C則可與XRCC3Thr241Met形成能夠大大降低患癌風險的大型基因復合物，來產生拮抗作用。除此之外，據S?derlund小組[29]報道，使BRCA1、BRCA2 分別與Rad51形成大型復合物，這能夠對乳腺癌進行預前和預后性檢測。同時，BRCA1與DNA修復蛋白復合物的這種相互作用保持了基因組的穩定性，使其可以作為腫瘤抑制因子來發揮作用。

因此，現階段可以通過對正常和癌變組織中的Rad51蛋白、BRCA1蛋白進行蛋白含量表達變化分析，研究二者與體系癌變的關系，同時也可以對BRCA1和Rad51的蛋白表達以及兩者與遺傳物質的相互作用進行全面分析。

4 BRCA1與Rad51相互作用的研究方法

目前，關于BRCA1與Rad51的相互作用研究方法，主要有熒光光譜法、圓二色光譜法、核磁共振法、透射電鏡法和微量熱涌動法等。

4.1 熒光光譜法

熒光光譜法是利用能夠發熒光的物質與自身濃度之間的關系進行研究的一種方法。通過Stern-Volmer[30]方程、雙倒數方程可求出結合位點數和結合常數，得到分子間的猝滅方式和機理，從而深層次研究其作用機理。Zhou Chenyi等[9]利用免疫熒光分析法，通過構建BRCA1- siRNA逆轉錄病毒載體來研究BRCA1羧基末端對Rad51蛋白表達含量的影響，發現BRCA1的羧基末端是順鉑治療之后進行Rad51和BRCA1復合物構建所必須的活性位點。霍彩霞等[31]運用熒光光譜，研究ONE(奧硝哇)與HSA(人血清白蛋白)在生理條件下的結合反應，發現兩者以靜態猝滅的方式發生作用。姚軍亮[32]則通過熒光動力學分析驗證了沒食子酸(GA)能夠對由Heparin 引發的 R3 多肽的自聚集度起抑制作用。董超[33]用免疫熒光法、免疫共沉淀法以及免疫印跡法研究p53和BRCA1在輻射誘導條件下對DNA雙聯斷裂損傷修復的影響，認為p53可以抑制BRCA1的重組過度修復，來維持正常的同源重組修復機制，同時，它還能夠維持染色體的穩定性。呂艷陽等[34]利用熒光光譜法，模擬人體自身酸堿度條件下阿托伐他汀鈣與牛血清白蛋白的熒光猝滅譜圖，對其猝滅方式、相互作用力以及結合位點進行了研究，認為二者間通過疏水作用力進行結合。

目前，以熒光法為主，結合免疫印跡等分析方法來分析蛋白與多肽相互作用。這種方法相對而言較為成熟，它能夠反映出蛋白與多肽之間的猝滅類型，并且能夠分析得出兩者之間的相互作用力類型，應用較為廣泛，但由于蛋白自身會攜帶發色團，在進行熒光實驗時，需要扣除蛋白自身的影響，構建對照組。

在進行BRCA1與Rad51復合物研究時，可用BRCA1作為猝滅劑，固定Rad51的濃度，按照一定的梯度依次增加BRCA1的濃度，測定復合物的熒光。由于BRCA1自身也有熒光效應，必須扣除空白。BRCA1與Rad51熒光強度越小，則兩者的相互作用效果越好。

4.2 圓二色光譜法(CD)

圓二色光譜法(CD)是根據手性分子的偏振光變化來測定物質結構[35-36]的方法，可用來估算多肽及蛋白中各種二級結構的含量[37]。林海波[38]曾利用同步輻射的真空紫外圓二色譜儀對處于溶液環境的蛋白質進行測定，這為蛋白質二級結構含量的測定提供了新方法。張新波等[39]利用圓二色法對磺胺嘧啶(SD)和牛血清白蛋白(BSA)進行結構分析，發現加入SD會使得BSA α-螺旋含量減少，構像發生變化。丁成榮等[40]則通過圓二色法對三環唑與BSA相互作用進行分析，結果顯示BSA的肽鏈發生收縮和重排，同時借助其他分析儀器發現三環唑還可使BSA發生構象變化。徐飛等[41]將CD應用于中藥小分子(如苯丙素類、黃酮類、萜類)與蛋白質相互作用研究中，發現小分子通過與DNA 結合，對蛋白質的二級結構產生影響，使其發生結構性改變，對蛋白的結構功能產生影響。應用圓二色法來研究小分子與蛋白的相互作用，此種方法較為廣泛，但是目前有關用CD法研究生物大分子與生物大分子之間的相互作用的報道并不多見，有待繼續深入研究。

依據前人報道，可采用這一方法嘗試對BRCA1-Rad51進行二級結構分析。測定BRCA1-Rad51及BRCA1與緩沖溶液的復合物的圓二色圖譜，得到BRCA1-Rad51復合物的圓二色光譜圖，利用CD Pro分析得到二級結構含量。隨著BRCA1濃度的升高，Rad51蛋白結構有序性增強，則其二級結構以α-螺旋為主。

4.3 核磁共振法(NMR)

蛋白與蛋白的相互作用主要依據X-ray和NMR技術來獲得蛋白質復合物的結構信息。進行蛋白質與蛋白質相互作用研究時，NMR[42]技術具有無可替代的作用，可應用其相關的順磁弛豫方法、分子間NOE檢測法以及化學位移擾動法來進行蛋白相互作用微觀分析。當兩者動力學行為過于復雜[42]，用其他方法難以檢測時，核磁共振法幾乎是獲取微觀作用信息的唯一手段。陳泉[43]運用NMR方法，對泛素類相關修飾蛋白質以及其與酶體系相互作用進行研究，認為泛素類修飾蛋白對酶的作用效果具有拮抗作用。張乃霞等[44]利用這種方法研究泛素-蛋白水解酶體通路，最終得到兩者相互作用力較弱的結論。史喆[45]則利用NMR技術，對人體的蛋白磷酸酶進行雙特異性的篩選研究，得到了在參與促使有絲分裂和細胞周期調控中占據主導地位的酶類。基于上述研究，我們可以采取NMR方法對BRCA1與Rad51的相互作用進行研究。

4.4 電鏡法(TEM)

透射電子顯微鏡(TEM)[46]在一定條件下能夠觀察到物質的亞顯微結構或者超微結構，有利于進行微觀結構動態分析，因此電鏡法較為常用。通常將電鏡法與其他分析法相結合，來進行結構分析。陳佳弘等[47]通過掃描電鏡觀察到絲素蛋白在CaCl2-H2O-C2H5OH體系中的微觀結構變化，認為絲素膨大，并且斷裂為片狀、層狀結構，晶體結構被破壞。吳麗萍等[48]利用透射電鏡與紅外光譜結合的方法，研究了pH對絲膠蛋白微觀結構以及宏觀構型變化的影響，發現pH越小，絲膠蛋白排列越緊密且體系越混亂。Hjalmarsson等[49]對鼠的腎小球內皮細胞進行電鏡分析，發現小鼠內皮細胞糖萼被內皮窗孔充滿。利用電鏡作相互作用研究時，可在適宜溫度下，將ssDNA、HsRad51加到預先配置好的緩沖溶液中，放置一段時間，再向其中加入BRCA1肽，經過一系列后續處理，對所形成的復合物BRCA1-HsRad51-ssDNA進行染色處理，進行電鏡觀察，得到微觀構型。

4.5 微量熱涌動法(MST)

Ludwig[50]首次闡明分子能夠在給定的溫度梯度條件下發生定向運動，并把這種分子在溫度梯度下的定向運動現象稱為熱泳動現象。Wienken 等[51]運用微量熱涌動方法，對溶液中生物大分子蛋白質與一些小分子的相互作用進行了深入研究。在進行BRCA1-Rad51相互作用時，可將不同濃度的未標記的BRCA1肽與固定濃度的熒光標記蛋白Rad51蛋白混合，靜置，再進行MST分析。在此過程中，Rad51作為受體，BRCA1作為配體，最終得到Kds值。與其他方法相比，MST法在蛋白與多肽的相互作用研究中應用較少，但它具有特殊的優勢。

4.6 其他方法

在進行生物大分子與生物大分子或生物大分子與有機小分子之間的相互作用研究時，除了上述幾種方法外，還可以結合BiFC[52-53]、GST Pull-down[54]等方法，使得作用機理更為清晰明了，也就更能闡明其基本作用規律以及結合力等詳細信息。

5 結語

乳腺癌的形成涉及多方面的因素，而基因發生功能性改變是乳腺癌發生的關鍵因素。BRCA1基因在一定條件下發生突變，會大大增加患癌風險。Rad51蛋白是生物體內進行同源重組修復過程的關鍵蛋白。通過對BRCA1與Rad51相互作用的研究，探索其相互作用機理、關鍵作用位點以及修復機理等，可為乳腺癌治療藥物的設計提供基礎。

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