鐵皮石斛原球莖組織培養研究進展

張 鑫

（天津創世生態景觀建設股份有限公司，天津 南開 300000）

鐵皮石斛（Dendrobium oきcinaleKimura et Migo）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生附生草本植物，因其老莖外呈黑色，又名為黑節草，是名貴中藥，居“中華九大仙草”之首，所含的主要成分為石斛多糖及生物堿，另外，還有酚類、菲類、芪類、倍半萜類及香豆素等。現代藥理研究證明石斛多糖具有抗腫瘤、增強免疫力的功能。但由于鐵皮石斛生長環境特殊，以及長期采挖，自然資源日趨枯竭，已被國家列為重點保護的野生藥材。從20世紀中期開始就有關于鐵皮石斛的研究，主要涉及組織培養方法、有效成分含量和藥理作用方面的研究。隨著研究的深入，發現鐵皮石斛在組織快繁過程中存在一些問題，例如通過組培生產出苗的成本過高，幼苗移栽成活率低，工廠化生產效率低。鑒于以上問題，現在對于鐵皮石斛原球莖的研究日益廣泛，鐵皮石斛原球莖是由鐵皮石斛種子通過無菌培養誘導繁殖形成的。它是種子萌發過程中，原胚萌動膨大，突破種皮后形成的淺黃色小圓錐形胚性組織。以鐵皮石斛原球莖為材料進行組織培養，通過改變培養基條件，可使鐵皮石斛原球莖生長旺盛，繁殖率高，具有較好的開發前景[1]。原球莖在培養基上可以直接分化成幼苗，也是制備人工種子的材料，使幼苗移栽成活率低的問題得到了解決；原球莖中也還含有同石斛苗相同的藥用成分，通過大規模培養來提取，同樣可以滿足藥材市場對鐵皮石斛的需求。

本文根據有關鐵皮石斛原球莖組織培養技術研究方面進行了綜述，以期為解決鐵皮石斛資源短缺問題提供一種有效方法。

1 培養基與激素

培養基是組織培養過程中培養材料吸收營養的來源，是決定組織培養成功與否的關鍵因素。而植物激素在植物組織培養過程中同樣起著主要作用，影響植物的生長代謝。研究證明，鐵皮石斛原球莖能夠通過固體培養基培養，從最終的效果來看，比如產量和多糖的含量，懸浮培養效果更加理想[2]。其原因可能是液體培養不僅可以使植株更加全面的接觸到培養基，植株可以吸收較多的營養物質，有利于細胞的生長和再分化[3]。而且在液體懸浮培養時，可以用細胞培養技術進行生理生化調控，該技術的應用可以大大提高控制能力，經過懸浮培養的原球莖多糖含量可達20.1%，野生鐵皮石斛中的含量也不過如此[4]。魏小勇[5]建立的鐵皮石斛原球莖懸浮系，原球莖分散性好、整齊均一，為鐵皮石斛大規模培養開創了新途徑，同時，該研究組發現在培養基中添加0.5 mg·L-1ABA預先培養30 d，原球莖的質量提高、同步性更好，可以大規模增殖鐵皮石斛的原球莖，用于制備人工種子。莫昭展等[6]的研究結果表明在改良MS中加入0.5 mg·L-1脫落酸，進行液體振蕩培養，原球莖增殖的效果比較好。蘇鈦等[3]用正交設計方法研究了對鐵皮石斛原球莖具有高效增殖影響的激素（6-BA，NAA，KT，馬鈴薯汁）以及配比，結果表明，原球莖在1/2MS+6-BA2.0 mg·L-1+NAA1.0 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1+3%糖的培養基上，以液體懸浮培養，原球莖50 d增殖達49.032 g。隨著工廠化育苗的發展，人們越來越重視經濟效益，采用其他材料來代替培養基的部分成分，以期減少生產成本，李思梅等[7]通過研究沼肥以不同比例替換鐵皮石斛原球莖增殖培養基中部分營養成分后，認為沼肥按一定比例替代培養基中的部分營養成分，可以促進原球莖增殖，并驗證了沼肥以10%的替代比例替代大量元素為最佳。蘇江[8]認為培養基的滲透壓對鐵皮石斛原球莖的生長有重要的作用，并以無菌鐵皮石斛原球莖為材料，通過添加不同濃度的甘露醇以調節其滲透壓，得出結論：添加低濃度的甘露醇可促進鐵皮石斛原球莖生長及增加多糖含量，而添加高濃度的甘露醇能明顯抑制鐵皮石斛原球莖生長及降低多糖含量，而且當甘露醇質量濃度為20 g·L-1時，隨時間的推移，原球莖活力、生長量、多糖含量和多糖產量總體呈上升趨勢。

2 碳源和氮源

細胞干物質中的主要元素是碳，碳元素是構成細胞骨架的重要成分，因此在培養基中添加一定的碳源是必要的[9]。在鐵皮石斛原球莖生長過程中，培養基中的糖提供植株生長所需要的碳源。在培養結束后，對培養基中的成分進行研究測定，發現添加的糖分幾乎全被植株吸收利用。在糖消耗的同時，原球莖干重逐漸增加[2]。何鐵光等[10]研究，添加不同的糖類物質作為碳源，發現蔗糖和葡萄糖能夠被優先利用，對原球莖生長速度和多糖積累含量的影響明顯高于乳糖和果糖。同時該研究組還研究了不同蔗糖濃度對鐵皮石斛原球莖生長速度和多糖積累的影響，對結果進行分析，鐵皮石斛原球莖生長的最佳蔗糖濃度和多糖積累所需的最佳蔗糖濃度是不同的。綜合各種因素考慮，如原球莖干重、多糖含量、生產成本等，實際生產應選取30 g·L-1的蔗糖濃度。

氮源的濃度對細胞的生長發育和代謝產物的形成有著重要的作用。培養基中的氮元素分為硝態氮和銨態氮，其NO3-/NH4+的比值的大小對原球莖的生長代謝有著相當大的影響。韋曉新等[11]研究表明，當氮源濃度范圍控制在為30～60 mmol·L-1、NO3-/NH4+分子比為 40∶20時，能夠促進原球莖生長，且高濃度NH4+會對原球莖生長產生抑制，因此在配培養基中應注意控制NH+4的濃度。宋經元等[12]以原有的研究基礎通過利用正交試驗設計來研究不同種類和濃度的氮源對鐵皮石斛原球莖生長增值的影響。得到的結果如下，硝態氮有利于鐵皮石斛原球莖鮮重和干重的增加；而銨態氮僅有利于鐵皮石斛原球莖鮮重增加，通過試驗還可以得到，無論對于鮮重還是干重，硝態氮和銨態氮的影響均不存在互作，培養基的最佳組合為：67-V培養液+30 g·L-1蔗糖+200 g·L-1馬鈴薯提取汁+100 mg·L-1（NH4）2S04+800 mg·L-1KNO3。李巧自等[13]以硝普鈉（SNP）為一氧化氮（NO）供體，研究了不同濃度的外源NO對鐵皮石斛原球莖生長、葉綠素含量、蔗糖合成酶（SS）活性和多糖積累的影響，認為低濃度的SNP有利于鐵皮石斛原球莖的生長，而高濃度的SNP可以促進多糖的合成。

3 金屬離子、真菌和天然附加物

培養基中的金屬離子來源于無機鹽中，植物從培養基中吸收金屬離子，以合成自身生長發育所需的物質，例如核酸、酶以及蛋白質等。金屬離子同樣也影響原球莖的生長代謝。林從發等[14]通過對5種金屬離子進行單因素實驗得到，影響原球莖生長增殖的順序為 Mg2+＞Fe2+＞Ca2+＞Mn2+＞Zn2+，并對3種天然附加物（馬鈴薯、蘋果和香蕉）對原球莖增殖的影響進行研究，結果表明：3種附加物對原球莖增殖影響差異極大，馬鈴薯和蘋果更有利于原球莖的增殖，該培養基上的原球莖長勢良好，顏色鮮綠，生長參數平均分別達到10.6和9.3，而香蕉則不利于原球莖的增殖，原球莖在該培養基上增殖緩慢，顏色發黃，最終死亡。得到原球莖增殖的最佳培養基1/2MS+10%馬鈴薯汁+3%蔗糖+NAA0.5 mg·L-1（含Ca2+2 mmol·L-1、Mg2+1.0 mmol·L-1、Mn2+0.1 mmol·L-1、Fe2+0.1 mmol·L-1、Zn2+0.03 mmol·L-1）。研 究 表明適宜濃度的鍺有利于懸浮培養的原球莖生長發育，通過在原球莖生長的培養基中添加適宜濃度的鍺發現，原球莖的鮮重，可溶性蛋白和葉綠素含量明顯增加，而且促進超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）活性升高，過氧化物酶（POD）的活性下降。因此適當濃度的GeO2（5 mg·L-1）對原球莖的生長有促進作用[15]。

鐵皮石斛是一種與真菌共生的蘭科植物。真菌促進其種子的萌發并與之形成菌根而促進其對營養物質的吸收[16]。從野生的鐵皮石斛中可以分離出相應的真菌菌株，而真菌添加物是通過將原始菌株進行分離、發酵培養并將得到的發酵液與菌絲體混合，然后勻漿滅菌后得到的。侯丕勇等研究發現真菌添加物不利于原球莖增殖分化[17]。宋經元等[12]利用從白蘭科植物體內分離的14種原始菌制的相應的真菌誘導子，發現其對原球莖的鮮重和干重沒有顯著的影響，這14種誘導子對原球莖的增殖都有不同程度的抑制，這與侯丕勇的研究結果是一致的。研究表明，活體真菌MF24在適宜的環境下能夠與原球莖共培養，而且會對原球莖的次生代謝水平產生影響[18]。在原球莖懸浮培養的后期加入MF24發酵制備的誘導子會促進原球莖多糖含量的積累[19]，并有利于原球莖的增殖生長，影響生物堿的合成[20]。在鐵皮石斛內生真菌的研究中，獲得了對組培苗的生長呈現不同影響的兩株內生真菌DCN-1和DCN-3，喻靜[21]通過試驗得出菌株DCN-1對組培階段和移栽后的組培苗和原球莖的生長無明顯影響，菌株DCN-3會導致組培階段的植株苗枯萎甚至死亡而對移栽后的組培苗影響不大，但抑制原球莖的生長。符合之前研究得出的結論，真菌添加物不利于原球莖的增殖分化。

在原球莖組織培養過程中通常添加香蕉汁、土豆汁、芋頭汁等天然附加物，這些物質中一般含有有機營養成分并對原球莖的誘導、增殖和分化有重要作用，天然附加物的研究是鐵皮石斛原球莖最重要的一個方面。張治國等[22-23]在培養基中分別添加了馬鈴薯、荸薺和香蕉三種相應的植物提取液來觀察其對原球莖的生長狀況的影響，得出馬鈴薯的增殖系數最高，香蕉的最低而且原球莖生長情況不良；未添加天然附加物的對照組的原球莖未分化，增殖比較明顯；而添加馬鈴薯的分化狀況也是很明顯的，分化成的幼苗顏色鮮綠，生長健壯；得到的結論為原球莖增殖時不添加天然附加物，原球莖分化時添加馬鈴薯的提取液。包英華等[24]為探討鐵皮石斛原球莖的培養基中添加物的作用，在1/2MS培養基中加入椰肉、甘蔗渣、香蕉皮和麥麩等4種添加物，研究不同濃度添加物和培養時間對原球莖生長和多糖含量的影響。結果表明，4種添加物對鐵皮石斛原球莖的增殖、分化和多糖含量均有一定影響，其中添加15.0 g·L-1甘蔗渣，培養60 d能明顯促進鐵皮石斛原球莖的增殖與分化（146.1%）；而添加20.0 g·L-1甘蔗渣，培養40 d能顯著提高鐵皮石斛原球莖多糖含量（50.4%）。這說明甘蔗渣是培養鐵皮石斛原球莖的適宜添加物，既能促進鐵皮石斛原球莖的生長發育，還能降低生產成本。徐玲等[25]同樣對多種天然有機物進行組合添加，探索具有促進作用的有機附加物新種類和新組合。在原球莖增殖培養基中添加100 g·L-1土豆汁與100 g·L-1其他有機物（香蕉汁、玉米汁、西瓜汁、荔枝汁及小麥面粉），以土豆汁與玉米汁對增殖的促進效果最佳（平均增殖5.66倍，鮮重提高4.12倍），而分化程度較低（分化率67.9%，排第3），適合作為原球莖繼代培養前期的添加成分。添加土豆汁與小麥面粉，原球莖分化率（平均95.1%）和鮮重增加（平均5.35倍）最高，分化苗健壯度最高，適合作為原球莖繼代培養后期的添加成分。在鐵皮石斛幼苗階段，對天然附加物也有進一步的研究，董燕婧等[26]以鐵皮石斛試管小苗為材料，以MS+0.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA+20 g·L-1蔗 糖 +6 g·L-1瓊脂為基礎培養基，采用正交試驗設計方法研究3種不同添加物（普通香蕉汁、食用馬鈴薯汁、活性炭）對鐵皮石斛幼芽生長的影響。結果表明，香蕉汁對鐵皮石斛的鮮質量、根數、莖高有促進作用，在促進莖的伸長方面效果較為顯著；馬鈴薯汁對鐵皮石斛的根長、莖粗影響不大，但在鮮質量和莖高等方面有顯著性促進作用；添加一定量的活性炭可以促進鐵皮石斛根的生長。在基礎培養基里添加30%香蕉汁，10%馬鈴薯汁，0.6 g·L-1活性炭，有利于鐵皮石斛的壯苗生根。

4 培養方式

搖床的轉速快慢對原球莖在培養過程中對氧氣的吸收有重要的影響，因此同樣影響原球莖的生長和多糖的積累。韋曉新等[11]的研究表明當初始培養基的pH值為7.0，接種量選擇30 g·L-1時，選取110 r·min-1為原球莖培養最適搖床轉速，有利于原球莖的生長和增殖。有研究表明原球莖在培養過程中發生褐變與搖床的轉速有關，經過懸浮培養90 d后，原球莖在高轉速培養中開始褐變，顏色發黃，而在低轉速中未褐變，長勢良好[5]。其結果與上述的試驗結果不一致，需要進一步研究。培養瓶的材質同樣對鐵皮石斛原球莖的生長有影響。萬珠珠等分別設置N6+玻璃瓶、N6+塑料杯、1/2 N6+玻璃瓶、1/2 N6+塑料杯4組處理進行增殖培養。認為塑料杯的污染率為8%，大于玻璃瓶的污染率3%；N6培養基在玻璃瓶下對鐵皮石斛原球莖分化最好[27]。

培養周期對懸浮培養下原球莖的生長代謝有很大的影響，當繼代培養的周期過長時，營養物質會逐漸消耗殆盡，原球莖的生長發育就會減緩，與此同時培養基中會積累有害物質，進一步影響原球莖的增值；而周期過短，不利于原球莖對培養基的吸收，浪費實驗材料。有研究表明的原球莖培養周期為45 d[22]；而宋經元等[28]經過研究表明，30 d的培養周期可使原球莖的干重與鮮重的比值、增殖系數等指標均達到最佳，而通過縮短培養周期的試驗發現，原球莖較以前相比生長周期明顯加快。魏小勇[5]的試驗證明原球莖的繼帶周期選擇10～15 d比較好，原球莖長勢良好而且不易發生褐變。

光照是植物生長發育所必須的，有研究表明原球莖在2 000 Lx光照強度下培養30 d后長勢良好，原球莖顏色鮮綠，其多糖的積累量達到了最大[29]。林小蘋等[30]以鐵皮石斛的原球莖、無根試管苗、莖段和葉片為材料，研究不同光質條件對鐵皮石斛原球莖增殖及4種材料中多糖和生物堿含量的影響。結果表明，在綠光下原球莖的增長率明顯低于其他光質，在白光和藍光下原球莖的增長率較好。在4種材料中，藍光能促進生物堿的合成，有利于生物堿積累，而紅光能促進碳水化合物的積累．有利于多糖含量增加，綠光則不同程度地抑制多糖和生物堿的積累。

隨著對原球莖規模化培養的研究日益增多，發現接種量與培養基體積對規模化培養有著顯著的影響，對工廠化培養有較大的指導意義，也可作為參考依據。宋經元等[28]經過試驗研究表明接種量和培養液體積對原球莖生長發育均有影響，接種量對干重與鮮重的影響要大于培養液的體積，而兩種因素的互作很小，對兩種因素的最佳處理為：接種量6.194 g·瓶-1+培養液體積150 mL·瓶-1或100 mL·瓶-1。

5 研究意義

由于長期過量采集使野生鐵皮石斛的資源迅速下降，難以滿足日益增長的需求而鐵皮石斛的組織快繁存在著許多問題，例如生產成本高、幼苗移栽成活率低等。如今對鐵皮石斛原球莖的組織培養研究日益廣泛，原球莖可以直接分化成幼苗、成熟植株，而且其可以制作成為人工種子來解決組織快繁中遇到的問題；原球莖中同樣含有藥用成分，可以直接從中提取以滿足需求。利用鐵皮石斛原球莖進行組培快繁，建立鐵皮石斛高效的組培快繁體系，不僅可保護鐵皮石斛野生資源，促進工廠化育苗，還有利于推進鐵皮石斛藥源的良性發展[31]。

[1]韋麗文，辛寧，李培泰，等.鐵皮石斛與鐵皮石斛原球莖質量比較的研究進展[J].中國醫藥指南，2013，25（9）：59-61.

[2]蘇江，羅興錄，何鐵光，等.鐵皮石斛原球莖固體培養和液體懸浮培養動力學研究[J].西北農業學報，2007，16（4）：161-165.

[3]蘇鈦，張曉南.液體懸浮培養促進鐵皮石斛原球莖高效誘導、增殖的研究[J].中國野生植物資源，2009，28（4）：54-56.

[4]何鐵光，楊麗濤，李揚瑞，等.鐵皮石斛原球莖多糖提取最佳工藝研究[J].西北農業學報，2006，15（5）：240-243.

[5]魏小勇.鐵皮石斛原球莖懸浮培養研究[J].現代中藥研究與實踐，2004，18（4）：7-11.

[6]莫昭展，貝學軍.鐵皮石斛原球莖增殖條件的研究[J].福建林業科技，2007，34（4）：55-58．

[7]李思梅，蘇有勇，李關艷，等.沼肥對鐵皮石斛原球莖增殖培養的影響[J].浙江農業科學，2015（12）：2002-2004.

[8]蘇江.培養基滲透壓對鐵皮石斛原球莖生長和多糖含量的影響[J].福建農業科學，2016（5）：475-479.

[9]邢建民，趙德修，李茂寅，等.水母雪蓮懸浮培養細胞生長和黃酮類活性成分合成[J].植物學報，1998，40（9）：836-841．

[10]何鐵光，楊麗濤，李楊瑞，等.蔗糖對鐵皮石斛原球莖生長與多糖積累的影響[J].安徽農業科學，2007，35（13）：3817-3819．

[11]韋曉新，蘇江，何鐵光.幾種因素對鐵皮石斛原球莖生長和多糖積累的影響[J].廣西農業科學，2008，39（5）：601-606．

[12]宋經元，郭順星，肖培根.氮源和真菌誘導子對鐵皮石斛原球莖懸浮培養的影響[J].云南植物研究，2008，30（1）：105-109.

[13]李巧自，高素萍，張科燕，等.外源一氧化氮對鐵皮石斛原球莖生長和多糖積累的影響[J].浙江農業學報，2016（4）：595-600.

[14]林叢發，鐘愛清，林云斌，等.鐵皮石斛類原球莖增殖和分化的研究[J].江西農業學報，2007，19（1）：84-86.

[15]唐鳳，丁小余，丁鴿，等.鍺對鐵皮石斛原球莖的生長及抗氧化酶系的影響[J].南京師大學報，2005，28（4）：86-89.

[16]宋經元，翱頃星.離體培養時真菌對鐵皮石斛和金釵石斛生長的影響[J].中國醫學科學院學報，2001，23（6）：547-551.

[17]侯丕勇，翱頃星.懸浮培養的鐵皮石斛原球莖在固體培養基上生長和分化的研究[J].中國中藥雜志，2005，30（10）：729-732.

[18]孟志霞，舒瑩，王春蘭，等.鐵皮石斛原球莖與活體真菌液體懸浮共培養研究[J].中國中藥雜志，2012，37（12）：1710-1714.

[19]楊慧，陳曉梅，郭順星.真菌誘導子對鐵皮石斛原球莖多糖含量的影響[J].世界科學技術-中醫藥現代化，2009，11（5）：719-722.

[20]陳曉梅，郭順星，孟志霞.真菌誘導子對鐵皮石斛原球莖的影響[J].中國中藥雜志，2006，41（22）：1692-1694.

[21]喻靜，蔣海俠，張保錢，等.兩株鐵皮石斛內生真菌對組培苗和原球莖生長的影響[J].植物病理學報，2017（4）：541-550.

[22]Zhang Z G,Liu H,Wang L,etal.The study on culture conditions of multiplication of protocorm-likebodies of Dendrobium candidum[J].Chin Tradit Herb Drugs（中草藥），1992,23(8):431-433．

[23]Zhang Z G,Wan L,Liu H,etal.Theres ear chonmedium of proli feration of protocorm of Dendrobium candidum[J].China J Chin Mater Med（中國中藥雜志），1993,18(1):16-19．

[24]包英華，潘超美，白音.四種添加物對鐵皮石斛原球莖生長及多糖含量的影響[J].熱帶亞熱帶植物學報，2014，22（3）：257-262.

[25]徐玲，陳自宏，楊曉娜，等.不同有機附加物對鐵皮石斛原球莖增殖和組培苗生根壯苗的影響[J].云南農業大學學報，2016 （2）：250-256.

[26]董燕婧，李博，程波翔，等.不同添加物對鐵皮石斛組培幼苗生長的影響[J].江蘇農業科學，2017 （6）：135-137.

[27]萬珠珠，牛來春，譚秀梅，等.培養基和容器對鐵皮石斛組培苗生長的影響[J].中國園藝文摘，2016（2）：43-44.

[28]宋經元，郭順星，肖培根.鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養的研究[J].中草藥，2004，35（9）：1042-1046．

[29徐步青，崔永一，郭岑，等.不同光照強度和培養時間下鐵皮石斛類原球莖生物量、多糖和生物堿量的動態變化[J].中草藥，2012，43（2）：355-359.

[30]林小蘋，賴鐘雄.不同光質對鐵皮石斛原球莖增殖及有效成分含量的影響[J].熱帶作物學報，2015，36（10）：1796-1801.

[31]林茜，林貴美，韓曉華，等.利用鐵皮石斛原球莖進行組培快繁[J].南方農業學報，2015，46（9）：1557-1560.