BRAF基因在甲狀腺癌細針穿刺標本中的表達研究

王力群 鄭 曦 吳欽穗 陳 魁 陳依期

（福州市第一醫院普外科13區，福建 福州 350009）

甲狀腺癌是最常見的內分泌系統惡性腫瘤，約占所有惡性腫瘤的1%～4.42%，以45～50歲多見，國內普查報道甲狀腺癌發病率為11.44/10萬，近年來其發病率呈增高趨勢，近十年中國甲狀腺癌發病率升高3.9倍，是所有實體腫瘤中，發病率上升最快的癌癥。每年全世界約有122 000例新發病例，男女發病率之比約為1∶（3～4），男性約（0.8～5.0）/10萬，女性約（1.9～19.4）/10萬。雖然發病率升高明顯，但病死率并沒有升高，約占癌癥死亡病例的0.4%。其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）占75%～85%。對于甲狀腺結節性質的診斷主要依靠彩超和甲狀腺細針穿刺（fine needle aspiration，FNA）細胞學檢查。BRAF V600E基因突變是PTC最常見的遺傳學因素，也是甲狀腺癌變過程中的早期事件[1-2]。本研究選取53例術后病理證實的甲狀腺乳頭狀癌患者，術前經過UG-FNA檢查提示見核異質細胞，制備細胞蠟塊行免疫組化檢測BRAF V600E突變蛋白表達，并與術后石蠟標本中BRAF V600E的表達進行對照，以檢測該方法可靠性。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取我院2014年7月至2017年3月甲狀腺乳頭狀癌病例53例，其中男性11例，女性42例；年齡32～69歲。平均年齡41歲。本組44例患者行患側甲狀腺腺葉+峽部+中央區淋巴結清掃，9例行功能性頸淋巴結清掃術。同時選取10例結節性甲狀腺腫或甲狀腺腺瘤良性病例石蠟標本進行對照。

1.2 穿刺方法和標本制備。UG-FNAB穿刺方法：術前常規檢查凝血功能，并停用抗凝藥物5～7 d以上，告知患者穿刺注意事項，征得患者同意后簽署知情同意書。進行FNA時，患者取仰臥位，肩下墊枕使頸部過伸，首先應用高頻超聲探頭確定穿刺靶區，選擇穿刺點，穿刺路徑應避開喉返神經、血管、氣管所在區域，確定腫塊部位、大小、活動情況、最淺表處，標記定位。碘伏常規消毒皮膚，鋪巾，一般不用局麻藥，若患者過分緊張或深部結節可適當予以局部麻醉后再行FNA，選擇7號針頭或22G～25G PTCD穿刺針，連接10 mL注射器，右手持注射器經標記點皮膚刺入，平行法超聲引導下進入腫塊內，到達適當深度確定在腫塊內后，回抽針栓，在維持負壓的狀態下，在腫塊內多點、多方向，反復穿刺抽吸3～6次，觀察針頭內有少許淡褐色組織碎屑為佳。緩慢解除負壓并退出針頭。視標本量情況，每個結節最多重復穿刺3次，穿刺涂片2張，95%乙醇快速固定，常規巴氏染色封片，剩余組織反復洗脫于細胞固定液中，備細胞蠟塊制備用，穿刺點局部有效按壓至少30 min，復查彩超無明顯出血后患者方可離開。

細胞蠟塊（cell block）制備：固定在細胞固定液中的剩余細針穿刺組織，多次離心后棄去上清液，用瓊脂沉淀包埋后，將凝固的細胞塊切片，常規脫水、石蠟包埋、HE染色，鏡檢。并進行BRAF V600E突變免疫組化檢測。

手術標本石蠟切片常規行BRAF V600E突變免疫組化檢測。

1.3 結果判斷：免疫組化染色采 用EnVision二步法，一抗BRAF V600E（VE 1）Ⅲ中杉公司提供：二抗及DAB試劑盒均購自邁新公司。高倍視野（×400）下每張切片隨機選擇5個細胞巢，每個巢細胞數不少于10個，以＜5%腫瘤細胞的細胞質染色為陰性，≥5%腫瘤細胞的細胞質染色為陽性，根據染色的強度分為：淡褐色（1+）；淡棕色（2+）；深棕色（3+）。

1.4 統計學方法：用SPSS 19.0統計軟件，計數資料以率表示，分類對比采用Crosstabs統計分析。

2 結 果

FNAB中甲狀腺乳頭狀癌細胞核極具特征性，包括毛玻璃狀（透明）細胞核、核內假包涵體、核溝、核仁、核的微絲等。53例PTC患者BRAF V600E突變蛋白表達陽性為43例，陽性率81.13%（43/53）。術前UG-FNAB結合BRAF V600E突變檢測陽性為38例，陽性率71.70%（38/53）。診斷符合率88.37%（38/43），特異性100.00%（10/10），假陰性率11.63%（5/43）。與術后石蠟切片免疫組化檢查相比χ2值1.31，P值0.25，提示差異無顯著性，對照組10例良性結節中有0例BRAF V600E突變。

3 討 論

BRAF基因全名為鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌基因同源體B1（v-raf murine sarcoma viraloneogene homolog B1）是1988年由Shunta Roikawa等在誘導禽原代細胞增殖和NIH3T3細胞的轉化過程中發現并克隆確認的，屬于RAF基因家族。BRAF是人類最重要的原癌基因之一，大約8%的人類腫瘤發生BRAF基因突變有關。BRAF基因V600E點突變具有很強的致癌作用，如促進惡變細胞包膜外浸潤，淋巴結轉移等，已經得到很多實驗的證實[3-4]。近年來，甲狀腺乳頭狀癌的分子特征和通路研究日趨深入。BRAF突變是目前其最常見的突變形式，BRAF基因是下游 MAPK 信號通路最強的激活劑。近期一項Meta分析結果顯示，BRAF突變與患者的復發、淋巴結轉移、甲狀腺外侵犯及AJCC分期（Ⅲ/Ⅳ期）有關[2,5-6]。

甲狀腺細針穿刺細胞學（fine needle aspiration）作為甲狀腺腫塊常規標準診斷方法，具有創傷小，痛苦小，易為患者接受等優點，而且術中冰凍切片由于冰晶效應，常常造成細胞核空殼，呈假性“核內包涵體”，導致甲狀腺乳頭狀癌的假陽性診斷，所以目前美國許多醫院將術前FNA作為甲狀腺術中冰凍的必要補充[7-10]。

細胞蠟塊切片中，瘤細胞相對集中，呈巢狀分布，細胞核形態大小不一，細胞呈單層排列，沒有細胞重疊擁擠現象，免疫組化效果好。同術后石蠟切片的免疫組化相比一致性較高，可作為術前FNA結合BRAF V600E突變檢測簡單、經濟、可靠的檢查方法。但如果穿刺標本量太少，影響CB的制作，容易造成假陰性診斷。

目前高頻超聲檢查對于甲狀腺結節的診斷敏感性為 100%，但特異性僅為40.6%，FNA 作為甲狀腺結節良、惡性鑒別的可靠方法，其敏感度為83%（65%～98%），特異度為92%（72%～100%），由于不同治療單位診療技術水平差異，即使FNA仍有較高誤差。約有10%～40%的甲狀腺結節通過穿刺活檢不能確定性質。本組實驗中采用FNA細胞蠟塊結合BRAF V600E突變檢測與術后病理相比，診斷符合率88.37%（38/43），特異性100.00%（10/10），對照組良性結節中BRAF V600E突變沒有發現陽性，提示BRAF V600E突變沒有假陽性，因此術前UG-FNAB結合BRAF V600E突變檢測可提高惡性甲狀腺結節的診斷率，由于BRAF V600E突變與甲狀腺癌淋巴結轉移密切相關，因此對甲狀腺癌分層治療及預后評估亦有指導意義。