桔梗總皂苷對PM2.5致肺損傷大鼠表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白A表達(dá)的影響

姚琳，張俊威，孟慶杰，董坤，王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150036）

PM2.5是大氣污染的主要來源，已成為影響人類生存環(huán)境和身體健康的主要因素。其粒徑小，可隨氣流進(jìn)入呼吸道深部，沉積在終末細(xì)支氣管和肺泡，其中的超細(xì)顆粒物甚至可通過肺泡進(jìn)入體循環(huán)，對機(jī)體造成損傷。越來越多的流行病學(xué)和毒理學(xué)研究資料表明，PM2.5與人類呼吸道疾病、肺癌和慢性心肺疾病的發(fā)病率密切相關(guān)[1－3]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AEC－Ⅱ)是肺泡上皮的干細(xì)胞，是合成和分泌肺泡表面活性物質(zhì)及其相關(guān)蛋白的主要細(xì)胞[4]。AEC－Ⅱ損傷后，可誘導(dǎo)上皮通透性增加，降低表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白（SP－A）的合成和分泌[5]。SP－A是由AEC－Ⅱ合成并分泌到肺泡腔中的膠原糖蛋白，能降低肺泡的液－氣界面表面張力，防止肺泡在低肺容量時塌陷，對于維持肺的正常功能至關(guān)重要[6－7]。已有研究報(bào)道，PM2.5可降低大鼠肺組織中SP－A的表達(dá)水平，提示AEC－Ⅱ受損[8]。桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum（Jacq.）A.DC.的干燥根，具有宣肺利咽、祛痰排膿的功效，是治療呼吸系統(tǒng)疾病的常用中藥，其主要活性成分為桔梗總皂苷。本研究中通過對PM2.5模型的復(fù)制，探討桔梗總皂苷對PM2.5致肺損傷大鼠SP－A表達(dá)的影響，以及對AEC－Ⅱ的修復(fù)作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

儀器：SorvaⅡST16型低溫離心機(jī)（Thermo公司）；KD－TS3A型自動組織脫水機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；KD－BM型生物組織包埋機(jī)（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司）；RM2235型組織切片機(jī)（德國徠卡公司）；BX4－1型生物顯微鏡，DP－72型組織生物信號采集分析系統(tǒng)（Olympus公司)；Infinite M200 Pro型酶標(biāo)儀（Tecan公司）；9600型定量PCR檢測儀（杭州博日科技有限公司）；VersaDoc 400mp型凝膠成像系統(tǒng)，PowerPac Universal型電泳儀，半干轉(zhuǎn)膜儀（BIO－RAD公司）；DYCZ－24DN型電泳槽（北京六一儀器廠）。

試藥：TRIzol試劑（美國Invitrogen公司，批號為66211）；Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit（Roche公司，批號為1485422）；FastStart Universal SYBR Green Master(ROX，Roche公司，批號為10277200）；SP－A、β－actin引物（哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司）；SP－A多克隆抗體（SANTA公司）；高效RIPA組織／細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；PMSF（Calbiochem公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（碧云天公司）；SDSPAGE凝膠配制試劑盒（碧云天公司）；PVDF膜（Millipore公司）；SP－A檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，SEA890Ra 96T，L140724594，Uscn）。桔梗（安國市奉義中藥飲片有限公司，批號為20141020），經(jīng)黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院王偉明研究員鑒定為正品，桔梗總皂苷純度為84.62%；試藥在給藥前研磨成粉，溶解，渦旋混勻。

動物：180～220 g Wistar大鼠50只，雌雄各半，由長春億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，SPF級，實(shí)驗(yàn)動物許可證號為SCXK（吉）2011－0004。

PM2.5：PM2.5濾膜由哈爾濱市環(huán)境監(jiān)測站提供。濾膜經(jīng)超聲洗脫處理后，收集PM2.5溶液，真空冷凍干燥后－20℃保存。臨用前，用生理鹽水配成質(zhì)量濃度為10 g／L的PM2.5混懸液。

1.2 方法

動物分組、造模及給藥：將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，即空白對照組(A組)，模型對照組(B組)，PGS高、中、低劑量(C1，C2，C3)組，各10只，雌雄各半。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除A組外，其余各組采用氣管滴注法進(jìn)行染毒，染毒劑量為10 mg／kg，每日1次，連續(xù)5 d。染毒第6天開始灌胃給藥，每日1次，A組和B組灌胃等量生理鹽水；C1，C2，C3組給藥劑量56，28，14mg／kg，每日1次，連續(xù)給藥14d。第14天給藥后1h，予1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈取血，分離血清－80℃凍存，用于檢驗(yàn)血清中SP－A含量；收集肺泡灌洗液(BALF)，于－80℃凍存?zhèn)溆茫糜跈z驗(yàn)BALF中SP－A含量；剪取左肺組織，4%甲醛固定，用于HE染色；取右肺組織中葉，用于提取RNA和蛋白質(zhì)。

HE染色試驗(yàn)：取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯中透明2次，放入石蠟內(nèi)進(jìn)行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機(jī)上，切片，將完全展開的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。

大鼠肺組織SP－A mRNA檢測：以實(shí)時熒光定量PCR法檢測SP－A mRNA的表達(dá)。提取RNA，用酶標(biāo)儀對RNA純度及濃度進(jìn)行測定，根據(jù)RNA濃度調(diào)整總RNA的體積，使各樣品逆轉(zhuǎn)錄體系所含的RNA量相同，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。引物序列[9]：SP－A上游5′－TAA GTG CTG CCC TCT GAC CT－3′，下游5′－AGG AGC CAT ACA TGC CAA AC－3′；β－actin上游5′－CGT TGA CAT CCG TAA AGA C－3′，下游5′－TGG AAG GTG GAC AGT GAG－3′。

大鼠肺組織SP－A蛋白檢測：按試劑盒操作步驟提取，檢測蛋白濃度，相同蛋白濃度加入12%SDS PAGE凝膠，分離，轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉3 h，加入一抗稀釋液4℃孵育，過夜，然后將膜與二抗稀釋液在室溫下?lián)u床孵育1 h。最后用化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像儀中拍照。

大鼠血清及BALF中SP－A測定：采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，血清和BALF樣品分別稀釋100，1 000倍后測定，操作程序按ELISA試劑盒要求進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用X±s表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺組織病理變化

剖檢時可見，B組大鼠肺部病變明顯，外觀充血、水腫，嚴(yán)重者肺葉分布散在大小不等的壞死灶，病變程度以模型組最重；病理學(xué)檢查顯示，病變主要在肺內(nèi)，病變性質(zhì)為間質(zhì)性肺炎和細(xì)支氣管肺炎，肺纖維增生，肺間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，支氣管及血管周圍有明顯的淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)不完整，排列不規(guī)則，肺泡上皮細(xì)胞脫落。A組大鼠肺組織基本正常。C1，C2，C3組大鼠的肺組織相對于B組，上述病變明顯減輕，且間質(zhì)性肺炎的程度隨著劑量的增加而逐漸減輕，C1組與A組相近。結(jié)果見圖1。可見，PGS具有改善PM2.5致肺損傷的作用，使肺組織病變程度明顯減輕。

圖1 各組大鼠肺組織病理檢測結(jié)果(HE×10)

2.2 大鼠肺組織SP－A mRNA和蛋白的表達(dá)

與A組比較，B組SP－A mRNA和蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（P＜0.01）；與B組比較，C1，C2，C3組增加SP－A mRNA和蛋白的表達(dá)，尤其以C1，C2組差異顯著（P＜0.01，P＜0.05），且C1組上調(diào)明顯。詳見表1和圖2。

表1 各組大鼠肺組織中SP－A mRNA和蛋白表達(dá)比較（s，n＝10）

表1 各組大鼠肺組織中SP－A mRNA和蛋白表達(dá)比較（s，n＝10）

注：與A組比較， P＜0.01；與B組比較， P＜0.05， P＜0.01。表2同。

蛋白(SP－A／ －actin)0.86±0.09 0.28±0.10 0.71±0.08 0.52±0.12 0.36±0.10組別A組B組C1組C2組C3組劑量[mg／（kg·d）]56 28 14 mRNA（SP－A／ －actin）0.978±0.023 0.261±0.006 0.783±0.018 0.516±0.036 0.331±0.043

圖2 各組大鼠肺組織SP－A蛋白表達(dá)

2.3 大鼠血清及BALF中SP－A的含量測定

與A組比較，B組大鼠血清中SP－A含量明顯上調(diào)（P＜0.05），而BALF中SP－A含量下降（P＜0.05）；與B組大鼠相比，C1，C2，C3組大鼠血清中SP－A含量下調(diào)，其中C1，C2組下調(diào)顯著（P＜0.05），BALF中SP－A含量均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清及BALF中SP－A含量比較（s，n＝10）

表2 各組大鼠血清及BALF中SP－A含量比較（s，n＝10）

組別A組B組C1組C2組C3組劑量[mg／（kg·d）]56 28 14血清（ng／mL）9.638±0.926 12.332±0.759 9.105±1.639 9.427±1.934 11.309±2.118 BALF（ng／mL）565.32±63.55 453.76±57.41 629.25±54.73 587.92±58.36 561.33±60.97

3 討論

PM2.5對肺組織的影響[10－12]，其病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為炎性改變，肺間質(zhì)有大量的炎性細(xì)胞浸潤，肺間隔增厚，毛細(xì)血管受損，細(xì)支氣管和毛細(xì)血管周圍亦有大量的炎性細(xì)胞浸潤。本試驗(yàn)中PM2.5致肺損傷的模型復(fù)制再次驗(yàn)證，其對肺損傷的作用，同時也證實(shí)，桔梗總皂苷可明顯減輕PM2.5致大鼠肺組織的炎癥表現(xiàn)，肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)趨向于正常，損傷得到修復(fù)。

大量炎性細(xì)胞的產(chǎn)生，一方面可抑制SP－A的基因表達(dá)[13]，另一方面可使AEC－Ⅱ凋亡、裂解、壞死，AEC－Ⅱ數(shù)目減少，且不能及時得到更新，進(jìn)一步導(dǎo)致SP－A表達(dá)下調(diào)。隨著SP－A mRNA下調(diào)效應(yīng)的積累、疊加與放大，其蛋白表達(dá)也逐漸下降。給藥后，藥物使炎性細(xì)胞數(shù)量下降，炎性細(xì)胞對SP－A mRNA的抑制作用減弱，且AEC－Ⅱ得到修復(fù)、增生，使SP－A mRNA表達(dá)增強(qiáng)，同時隨著SP－A基因表達(dá)的增多，被翻譯蛋白量增加，其蛋白表達(dá)提高。

SP－A的合成和分泌具有一定的肺特異性，主要由AEC－Ⅱ表達(dá)。正常情況下，SP－A在血液中是不表達(dá)或表達(dá)很微量的，但當(dāng)肺泡上皮細(xì)胞和周圍毛細(xì)血管受到炎性細(xì)胞的浸潤而造成不同程度的損傷時，肺泡毛細(xì)血管通透性增加，SP－A滲漏到肺泡毛細(xì)血管中并隨血液流入血循環(huán)[14]，導(dǎo)致SP－A水平在體循環(huán)血液中上升，故血清中SP－A的水平可反應(yīng)肺損傷的嚴(yán)重程度。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，PM2.5可使大鼠BALF中SP－A含量下降，而使血清中SP－A含量增加，提示PM2.5可導(dǎo)致AEC－Ⅱ及毛細(xì)血管受損。而PGS各劑量均能增加BALF中SP－A含量，并降低血清中SP－A含量，提示PGS對受損的AEC－Ⅱ及毛細(xì)血管具有一定的修復(fù)作用，且能恢復(fù)AEC－Ⅱ的正常合成和分泌SP－A的功能。

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