四季草顆粒純化工藝改進研究

龐秀清，李勇軍，何迅

（1.貴州醫科大學·貴州省藥物制劑重點實驗室，貴州貴陽550004；2.貴州省食品檢驗檢測所，貴州貴陽550004）

四季草顆粒已上市銷售多年，用于治療泌尿系統疾病，療效顯著[1－2]。原生產工藝為水煮醇沉工藝，乙醇用量較大，工藝耗時較長，能耗大，有效成分損失也較為嚴重，可能會影響其療效。吸附澄清劑純化中藥提取液是近年發展起來的一種新技術[3]，具有用量少、工藝簡單、天然無毒、成本低、有效成分損失少等優點，已廣泛用于中藥提取純化工藝研究。本研究中采用吸附澄清工藝代替傳統工藝用于四季草顆粒工藝改進，不僅克服了傳統工藝的弊端，同時對中藥民族藥資源的研究開發也起到了探索和示范作用。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

LC－10Avp型高效液相色譜儀（日本島津公司）；WML色譜工作站（廣西威瑪龍色譜科技公司）；AE240型電子天平（十萬分之一，梅特勒－托利多儀器上海有限公司）。

1.2 試藥

槲皮苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為111538－200403）；四季紅Polygonum capitatum D.Don，車前草Plantago asiatica藥材購于貴陽市藥材市場，由貴陽醫學院藥物研究開發中心生藥學研究室（中藥民族藥標本館長）龍慶德教授鑒定，符合相關規定，均為正品[1，4－6]；殼聚糖（浙江玉環縣海洋生物化學有限公司）；ZTC1＋1天然澄清劑（天津振天成科技有限公司）；101果汁澄清劑（上海沃遜生物工程有限公司）；明膠（上海魯博明膠有限公司）；果膠酶（杰諾生物酶公司）；甲醇為色譜純（美國Tedia公司），水為純凈水；甲睪酮片（天津飛鷹制藥有限公司，批號為0804002）；前列康(浙江康恩貝制藥股份有限公司，批號為081028)；消痔靈(北京雙鶴高科天然藥物有限公司，批號為090705)。

1.3 動物

昆明種小鼠40只，體質量18～22 g，雌雄兼用，動物合格證號為云動管9806號。將小鼠隨機分為4組，各10只。

2 方法與結果

2.1 槲皮苷含量測定[7－11]

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇－0.1%磷酸（38∶62）；流速：1 mL／min；檢測波長：360 nm；柱溫：35℃。理論板數按槲皮苷峰計算應不低于5 000。在該色譜條件下，按2005年版《中國藥典(一部)》附錄ⅥD中高效液相色譜法測定，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

稱取槲皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度為50 μg／mL的溶液，搖勻，即得對照品溶液。按處方比例稱取經粉碎成粗粉的四季紅和車前草，加水煎煮3次（12倍、8倍、8倍），濾過，合并濾液，濃縮至1∶6[藥材(g)∶藥液(mL)]，備用，即得四季草顆粒提取液；精密吸取試驗樣品適量，用濾膜（0.45 μm）濾過，即得供試品溶液。

2.2 吸附澄清劑選擇[12－13]

取樣品提取液，均分為7份，1份取樣測定槲皮苷的含量，其余6份分別按比例加入101果汁澄清劑、殼聚糖、ZTC1＋1、明膠、果膠酶5種常用吸附澄清劑，攪拌，靜置過夜，抽濾，量取濾液體積，分別取樣測定槲皮苷含量和總固體物。以槲皮苷轉移率和總固體收率為評價指標進行評價，水煎藥液槲皮苷提取率為63.15%，總固體收率為16.75%。結果見表1。可見，以殼聚糖為吸附澄清劑的澄清效果最好，故選擇殼聚糖作為四季草顆粒水提液的吸附澄清劑。

表15 種不同吸附澄清劑篩選試驗結果（%，n＝3）

2.3 正交試驗設計

2.3.1 因素水平表

根據上述試驗結果，用殼聚糖處理綜合效果較好，故采用正交試驗對其吸附除雜的影響因素進行考察。通過預試驗，藥液的濃縮比例（因素A）、吸附澄清劑加入量（因素B）、藥液的pH（因素C）是影響其吸附效率的主要因素[7]。正交試驗設計因素水平見表2。

2.3.2 指標選擇

采用綜合評分法，以槲皮苷和總固體物轉移率為評價指標進行評價，權重系數分別為0.8和0.2。綜合評分值＝(槲皮苷轉移率／最大槲皮苷轉移率)×80＋(總固體轉移率／最大總固體轉移率)×20。結果見表3。

表2 L9（34）正交試驗因素水平表

2.3.3 方差分析

由表4可知，三因素均有顯著性差異（P＜0.05）；在所選因素范圍內，各因素作用主次順序為A＞C＞B。最佳工藝條件為A3B2C2，即藥液濃縮至1∶8[生藥(g)∶藥液(mL)]，pH＝4，每升藥液加入1%殼聚糖冰醋酸溶液100 mL。靜置24 h，抽濾，收集濾液，備用。

表3 L9(34)正交試驗安排及結果

表4 方差分析結果

2.4 原純化工藝與新純化工藝比較

結果見表5。四季草顆粒藥材水煎煮液采用殼聚糖吸附純化，槲皮苷損失較小；采用乙醇沉淀處理，槲皮苷損失較大；2種處理方法所得總固體物和水煎液比較均降低了約35%，達到了試驗目的。采用殼聚糖處理，避免了使用大量乙醇，有利于安全生產。

表5 原工藝與新工藝研究結果（%，n＝3）

表6 對甲睪酮引起小鼠前列腺增生的影響（n＝3）

表7 對消痔靈引起小鼠前列腺炎的影響（n＝3）

2.5 原純化工藝與新純化工藝樣品藥效學比較

取2.4項下所得樣品，加入蒸餾水配制成溶液。以0.35 g／kg的劑量進行藥效學試驗，考察四季草顆粒對甲睪酮所致小鼠前列腺增生，對消痔靈所致小鼠前列腺炎的影響[14－16]。實驗過程中，模型組死亡1只，原工藝組死亡2只，新工藝組死亡1只。結果見表6和表7。與模型組比較，四季草顆粒新工藝組、原工藝組前列腺質量及前列腺指數明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），但無顯著性差異（P＞0.05）。與模型組比較，四季草顆粒新工藝組、原工藝組前列腺質量及前列腺指數明顯降低（P＜0.01，P＜0.05），但無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討論

預試驗時，為保證吸附澄清劑在試驗過程中能發揮各自的優點，故再進行正交試驗，進一步優化工藝條件，以期得到最佳吸附澄清工藝。選擇處方主藥四季紅中含量較高的槲皮苷為考察指標能較客觀地評價該新工藝，同時，經過對新工藝、原工藝所制備樣品進行藥效學比較試驗，發現2種工藝的藥物效應并無顯著性差異，進一步證明了該工藝的可行性，達到了多方面客觀評價的要求。

該工藝的改進不僅可以節省能源，保護環境，還可以提高經濟效益。吸附澄清劑用于中藥制劑的純化工藝已有報道，本研究中嘗試將其用于多種藥材提取液的純化工藝中，結果適用于很多藥材，但是不適用于含糖量較高的中藥材。

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