高效液相色譜法同時測定炒防風中升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷含量

焦坤

（安徽省阜陽市食品藥品檢驗檢測中心，安徽阜陽236500）

防風為傘形科植物防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，具有解表、祛風、勝濕、止痙的功效，用于感冒頭痛、風濕痹痛、風疹瘙癢及破傷風等[1]。炒防風為防風的加工炮制品，臨床應用廣泛，常與白術、陳皮、白芍同用，健脾止瀉，用于肝旺脾虛、腸鳴腹痛、大便泄瀉，瀉必腹痛。防風的化學成分主要有色原酮類[2]、香豆素類[3－4]、揮發油[5－8]、多糖類[9]等。研究顯示，防風中的色原酮是其發揮療效的物質基礎[10－12]。目前，關于防風有效成分含量測定的研究較多。胡紫艷等[13]測定了不同產地防風中的升麻素、升麻素苷、5－O－甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷4種色原酮。邵留英等[14]對不同產地的防風中升麻苷及5－O－甲基維斯阿米醇苷的含量進行了對比分析。趙博等[15]用高效液相色譜法（HPLC）同時測定了防風中6個主要成分的含量。2015年版《中國藥典（一部）》規定防風的質量分析，以升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷為指標性成分。而關于炒防風含量測定方面研究較少，缺乏有效的質量控制指標。本研究中建立了同時測定升麻素和5－O－甲基維斯阿米醇苷含量的HPLC法，現報道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Thermo UItiMate 3000型高效液相色譜儀(美國賽默飛世爾科技公司)，包括DAD3000型檢測器、變色龍7.2軟件工作站；梅特勒XPE205DR型電子天平(0.01 mg)；ELMA－E100H型超聲清洗儀(德國艾爾瑪儀器公司)。

試藥：升麻素苷（Prim－O－glucosylcimifugin）對照品（批號為111522－201310，含量為95.0%），5－O－甲基維斯阿米醇苷（5－O－methylvisammioside）對照品（批號為111523－201509，含量為95.8%），均由中國食品藥品檢定研究院提供。炒防風(編號分別為CFF01，CFF02，CFF03，CFF04，CFF05，CFF06，CFF07，CFF08，CFF09，CFF10，安徽省萬生中藥飲片廠)經阜陽市食品藥品檢驗檢測中心許世輝主任中藥師鑒定為防風Saposhnikovia divaricata(Turcz.)Schischk.的炒制品；甲醇（分析醇，國藥集團化學試劑有限公司）；純化水(自制)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：Rigol－C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇－水(40∶60)；流速：1.0 mL／min；柱溫：35℃；檢測波長：254 nm；進樣量：5 μL。理論板數按升麻素苷峰計算應不低于4 000。在此色譜條件下，樣品中升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷能達到有效分離。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

對照品貯備液：取升麻素苷對照品15.39 mg，5－O－甲基維斯阿米醇苷14.85 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加入適量甲醇溶液，超聲溶解，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.292 4 g／L的升麻素苷對照品溶液和0.284 5 g／L的5－O－甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液。

供試品溶液：取炒防風粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇20 mL，精密稱定，加熱回流2 h，放冷，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密吸取升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷混合對照品溶液1.0，2.0，2.5，5.0，10.0 mL，分別置25 mL容量瓶中，加入甲醇溶液定容，搖勻，再加入貯備液，得6個不同質量濃度的混合對照品溶液。按擬訂色譜條件測定，以質量濃度(X)為橫坐標、峰面積(Y)為縱坐標，繪制升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷的標準曲線，分別得回歸方程Y＝119.706 4 X＋0.038 29（r＝0.9994），Y＝135.704 5 X＋0.083 54（r＝0.999 4）。結果表明，升麻素苷的質量濃度在0.011 6～0.292 0 g／L范圍內，5－O－甲基維斯阿米醇苷的質量濃度在0.011 4～0.285 0 g／L范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取線性關系考察項下稀釋10倍的混合對照品溶液，依法連續進樣5次，每次5 μL。結果麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為1.309%和1.347%(n＝5)，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取炒防風(編號為CFF02)約0.5 g，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣。結果麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷的平均含量為0.234 5%和0.205 1%，RSD分別為1.895%和2.058%(n＝6)，表明方法重復性好。

穩定性試驗：取炒防風(編號為CFF02)約0.5 g，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時按擬訂色譜條件進行分析。結果麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷峰面積的RSD分別為0.993 7%和0.996 4%(n＝6)。表明供試品溶液在24 h內穩定。

加樣回收試驗：取炒防風(編號為CFF02)6份，各0.25 g，精密稱定，分別置100 mL具塞錐形瓶中，再分別加入2.2項下混合對照品貯備液各2.0 mL，按2.2項下方法平行制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件依法測定。結果見表1。

2.4 樣品含量測定

取10批不同產地的炒防風各0.5 g，每批2份，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進行分析。精密量取供試品溶液5 μL，記錄色譜峰面積，按外標一點法計算各批炒防風含量。結果見表2。可見，不同產地炒防風所含的麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷差異較大，可能與各地氣候條件、土壤狀況、緯度、海拔、高度、日照強度、栽培條件、采集季節及藥材的儲存條件等因素不同有關[5]。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

防風中主要含有色原酮類物質，常見的色原酮包括升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷等。2015年版《中國藥典（一部）》中，防風項下有關于二者的含量測定，但炒防風未見相關報道。參考2015年版《中國藥典（一部）》防風的質量標準，選擇升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷作為炒防風的質量控制指標，為進一步研究其質量標準提供科學參考。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

表2 樣品含量測定結果(%)

3.2 測定波長的選擇

經在線全波長紫外吸收光譜掃描分析，上述2個分析物在254 nm波長處有良好的紫外吸收強度。本研究中，采用254 nm作為檢測波長時，升麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷同時成為主要吸收峰，分離度好，峰形良好，且其他物質對二者的測定無干擾，故選擇254 nm作為測定波長。

3.3 流動相的選擇

分別比較了甲醇－水、乙腈－水、甲醇－0.1%磷酸水等流動相，結果以甲醇－水作為流動相時基線較平穩，且對色譜柱損傷小，各色譜峰的分離度和理論板數均能達到要求，且其他物質對麻素苷和5－O－甲基維斯阿米醇苷的測定無干擾，最終采用甲醇－水作為流動相。

3.4 提取方法的選擇

考察了以甲醇、乙醇、50%甲醇為提取溶劑的提取方法，結果甲醇的提取效率高于乙醇和50%甲醇。由于炒防風中含有大量的多糖[15]和單寧等，難以直接進行HPLC分析。采用甲醇為提取溶劑，樣品較清潔，又兼顧了甲醇對色原酮提取效率高的特性。故選擇甲醇為提取溶劑。

3.5 方法的適用性

本試驗所建立的HPLC法經方法學驗證，具有方便、快捷、準確、簡便、重復性好等特點，可用于炒防風的質量控制，亦為含有炒防風的成方制劑的質量控制提供了參考。含量測定結果表明，不同批次的炒防風中二者的含量差異較大。

3.6 不足

中藥發揮療效是其所含有的化學物質共同作用的結果。限于條件，本試驗中只測定了炒防風中所含色原酮類物質中的2種，因防風經過炒制后，化學成分會發生一定變化，其他色原酮類物質如升麻素、亥茅酚苷等暫未進行研究。

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