sTLR4的研究進(jìn)展*

吳 憲 李 濤

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，合肥 230022)

1 sTLR4的概述

1.1sTLR4的來(lái)源 TLR4受體屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，結(jié)構(gòu)上主要由胞外域、跨膜域和胞內(nèi)域構(gòu)成。其胞外域由富含亮氨酸的重復(fù)序列組成，能結(jié)合相關(guān)配體。跨膜域是介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)域進(jìn)化保守，因其結(jié)構(gòu)類似于IL-1受體，故稱為T(mén)IR(Toll/IL-1 receptor)區(qū)。TLR4的固有配體主要有細(xì)菌脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、熱休克蛋白(Heat shock protein,HSP)60、軟脂酸等[1]。

一個(gè)基因的不同外顯子和內(nèi)含子可以組合并一起被剪切下來(lái)，從而產(chǎn)生出不同的mRNA。一個(gè)外顯子或內(nèi)含子是否被剪切保留在成熟的mRNA中也是可以變化的，故稱之為可變剪切。Pre-mRNA可變剪切過(guò)程在真核生物中極為普遍，尤其是脊椎動(dòng)物。TLR4的mRNA前體在成熟過(guò)程中會(huì)進(jìn)行選擇性剪切，產(chǎn)生TLR4 mRNA亞型。Iwami等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)，用DNA印跡技術(shù)可檢測(cè)到多種TLR4 mRNA亞型。其中一種亞型與成熟TLR4 mRNA大致相同，區(qū)別在于第二和第三個(gè)外顯子之間有額外的144 bp的插入序列，此144 bp插入序列可在TLR4 mRNA的基因組文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，且符合堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)則，是TLR4 mRNA選擇性剪切產(chǎn)物。此段插入序列在110 bp處有一個(gè)框內(nèi)終止密碼子，可編碼一種穩(wěn)定存在的可溶性的蛋白質(zhì)，即sTLR4。杜金苓等[3]發(fā)現(xiàn)綿羊TLR4基因存在3種剪接體形式，除正常TLR4外將兩種新型剪接體分別命名為Var2-TLR4和Var3-TLR4。Var2-TLR4在第2外顯子與第3外顯子之間有222 bp堿基的插入，但在插入序列中提前出現(xiàn)終止密碼子，導(dǎo)致Var2-TLR4可能出現(xiàn)一個(gè)由86個(gè)氨基酸構(gòu)成的蛋白，這種情況與鼠sTLR4非常相似。

1.2sTLR4的作用機(jī)制 研究中發(fā)現(xiàn)，額外的144 bp插入序列編碼122aa的蛋白質(zhì)，開(kāi)始的86aa與TLR4胞外域相同，只有87～122aa不同[2]。由于sTLR4與TLR4胞外域結(jié)構(gòu)上極為相似，Hyakushima等[4]人工制備一種可溶形式的缺少胞質(zhì)域和跨膜域的TLR4，包含推測(cè)的胞外域(Met1-Lys631)。結(jié)合試驗(yàn)證明了sTLR4能與髓樣分化蛋白2(Myeloid differentiation protein-2,MD-2)結(jié)合，而且sTLR4/MD-2復(fù)合體能結(jié)合LPS，單獨(dú)的sTLR4則不能結(jié)合LPS，且sTLR4/LPS復(fù)合體能抑制LPS誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB信號(hào)通路激活[4-6]。因此，sTLR4能與MD-2形成復(fù)合體，與細(xì)胞膜上的TLR4信號(hào)復(fù)合體競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS等配體，阻斷TLR4信號(hào)通路，從而抑制LPS等配體引起的炎癥反應(yīng)。

1.3sTLR4的分布 編碼sTLR4的TLR4 mRNA亞型廣泛存在于多種組織中，包括腦、心、腎、胸腺、脾、小腸和睪丸。sTLR4也在多種體液中存在，包括唾液、血清、關(guān)節(jié)液、腦脊液、羊水和胸腹水。Zunt等[7]在健康人的靜息唾液中發(fā)現(xiàn)了sTLR4，并且有4種不同大小的sTLR4，分子質(zhì)量分別為90、78、54和44 kD，但只有90 kD的sTLR4有生理活性。在健康人的血清中也可檢測(cè)到sTLR4，但是濃度極低。有文獻(xiàn)報(bào)道，在LPS直接刺激后，血液中會(huì)釋放大量的細(xì)胞因子、趨化因子以及sTLR4[8]。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)可檢測(cè)到關(guān)節(jié)液中的sTLR4，并且不同部位關(guān)節(jié)液中sTLR4含量不同，掌腕關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液中sTLR4含量高于膝蓋關(guān)節(jié)液[9]。健康人腦脊液中也可檢測(cè)到sTLR4，腦脊液中sTLR4水平明顯高于血清中sTLR4水平，并且在人類免疫缺陷病毒感染且患有認(rèn)知障礙的患者腦脊液中sTLR4水平顯著高于正常人[10]。妊娠期婦女體內(nèi)羊水也能檢測(cè)到sTLR4，羊水中sTLR4水平隨著羊膜腔微生物入侵而升高[11]。

2 sTLR4的應(yīng)用

2.1作為炎癥的拮抗劑，抑制炎癥反應(yīng) sTLR4與TLR4胞外域在結(jié)構(gòu)上極為相似，能與細(xì)胞膜上的TLR4競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合配體，阻斷TLR4信號(hào)通路，抑制配體引起的炎癥反應(yīng)。Mitsuzawa等研究證明sTLR4與MD-2結(jié)合，sTLR4/MD-2復(fù)合體能與細(xì)胞表面TLR4受體復(fù)合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合LPS，顯著降低LPS誘導(dǎo)的NF-κB活化和IL-8的分泌[4,5]。在小鼠氣管輸注LPS能引起小鼠肺部炎癥。在LPS輸注后氣管輸注sTLR4/MD-2復(fù)合體后支氣管肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和TNF-α的水平顯著降低，有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥[5]。Katharina等設(shè)計(jì)了一種LPS“陷阱”，將MD-2融合到sTLR4的羧基末端，發(fā)現(xiàn)其在體外能結(jié)合LPS，抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生[12]。Goncalo等[13]發(fā)現(xiàn)在條件培養(yǎng)基中加入不含MD-2的sTLR4能顯著減少Co2+或 Ni2+誘導(dǎo)的IL-8的產(chǎn)生量，而LPS誘導(dǎo)的IL-8的表達(dá)未受影響。

2.2研究信號(hào)分子與TLR4的相互作用 sTLR4與TLR4胞外域結(jié)構(gòu)極為相似，能與TLR4配體結(jié)合，可以利用sTLR4代替TLR4胞外域，研究信號(hào)分子與細(xì)胞膜上TLR4受體的相互作用。

在研究中草藥小青龍湯對(duì)于過(guò)敏炎癥反應(yīng)的抑制作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，小青龍湯能降低屋塵螨引起的細(xì)胞TLR4表達(dá)，加入sTLR4或粗糙型沙門(mén)菌LPS能減弱小青龍湯對(duì)于神經(jīng)生長(zhǎng)因子和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素的抑制效果，小青龍湯能抑制人類肺泡上皮細(xì)胞的p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體和NF-κB的Ser536磷酸化，而sTLR4能削弱此抑制效應(yīng)，證明小青龍湯可能通過(guò)有細(xì)胞膜上TLR4參加的信號(hào)通路抑制過(guò)敏炎癥反應(yīng)[14]。

在研究MBL對(duì)白色念珠菌誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)MBL能減低白色念珠菌誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)，用抗TLR4抗體能抑制MBL與白色念珠菌誘導(dǎo)的細(xì)胞結(jié)合，提示TLR4是MBL作用位點(diǎn)。免疫共沉淀試驗(yàn)顯示MBL能與sTLR4共沉淀，進(jìn)一步驗(yàn)證了MBL與TLR4的相互作用[15]。

在研究人類β防御素(Human β-defensin 3,HBD-3)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機(jī)制時(shí)，用sTLR4代替TLR4胞外域，發(fā)現(xiàn)sTLR4能與HBD-3結(jié)合，且sTLR4能競(jìng)爭(zhēng)性抑制HBD-3與imDC結(jié)合，證明HBD-3與imDC的結(jié)合位點(diǎn)與TLR4有關(guān)[16]。

在研究代謝標(biāo)記的脂低聚糖(Lipooligosacc-haride,LOS)和MD-2的純化復(fù)合物[3H]LOS-MD-2與放射性碘化標(biāo)記內(nèi)毒素-MD-2復(fù)合體LOS-MD-2[125I]，這兩種復(fù)合物與TLR4的結(jié)合性能，用sTLR4直接比較兩種標(biāo)記LOS-MD-2的與細(xì)胞膜上TLR4受體結(jié)合性能[17]。

2.3作為炎癥診斷工具 TLR4作為先天性免疫應(yīng)答的重要受體，能識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(Patho-genassociated molecular patterns,PAMPs)和危險(xiǎn)相關(guān)分子模式(Danger-associated molecular patterns,DAMPs)，偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)NF-κB的活化，產(chǎn)生大量的炎癥因子。TLR4 基因敲除可使機(jī)體尤其是內(nèi)臟脂肪組織處于低度炎癥狀態(tài),免疫細(xì)胞的數(shù)量和比例失調(diào)[18]。sTLR4被認(rèn)為是TLR4的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制之一，在炎癥時(shí)水平會(huì)升高，可作為炎癥診斷的生物標(biāo)志物。

在口腔扁平苔蘚患者的靜息唾液中，檢測(cè)到sTLR4水平顯著升高[7]。Ten等深入探究各種炎癥疾病中sTLR4的水平，發(fā)現(xiàn)感染性炎癥患者的血清sTLR4水平顯著高于非感染性炎癥患者；對(duì)比病毒感染患者，細(xì)菌感染患者的超敏C反應(yīng)蛋白和sTLR4濃度更高[8]。在患骨關(guān)節(jié)炎的患者的掌腕關(guān)節(jié)和膝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)液中sTLR4水平顯著高于正常人[9]。在動(dòng)脈瘤蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的腦脊液中，sTLR4水平隨時(shí)間推移顯著上升，但是有一定的延遲[19]。在非酒精性脂肪肝和肝纖維化患者中，血清sTLR4水平顯著高于正常人[20]，sTLR4水平隨肝纖維化程度加深而升高，在一定程度上能預(yù)測(cè)非酒精性脂肪肝和肝纖維化以及疾病的進(jìn)展。在乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)陰性的慢性病毒性乙型肝炎患者的血清sTLR4水平顯著高于正常人[21]，且與HBV DNA及丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平成正相關(guān)。

2.4sTLR4在癌癥中的作用 研究證明在結(jié)腸癌、乳腺癌[22]、胃癌等不同的腫瘤組織中，TLR4的表達(dá)較正常組織均有所升高。TLR4的活化能引起促炎因子和其他介質(zhì)的產(chǎn)生來(lái)抵抗病原微生物，而TLR4的過(guò)度表達(dá)則會(huì)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、免疫逃避[23]。而sTLR4作為T(mén)LR4的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制之一，在癌癥患者的血清中水平顯著升高，與癌癥患者的預(yù)后有密切關(guān)系。

在研究非小細(xì)胞型肺癌(NSCLC)患者的預(yù)后時(shí)發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中sTLR4水平顯著高于正常人，Ⅱ期或Ⅲ期NSCLC患者的血清sTLR4水平明顯高于Ⅰ期NSCLC患者，而Ⅳ期NSCLC患者血清sTLR4明顯低于Ⅲ期NSCLC患者，即在局限性NSCLC中血清sTLR4水平隨TMN分期增加而增加，而在轉(zhuǎn)移性NSCLC患者中，sTLR4水平顯著降低[24]。此外，TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期的 癌癥組織中TLR4表達(dá)水平與血清sTLR4水平呈負(fù)相關(guān)，而在全階段患者和Ⅲ期患者中TLR4表達(dá)與血清sTLR4水平無(wú)明顯相關(guān)性[25]。血清sTLR4水平與NSCLC的病理類型也有關(guān)系，鱗癌患者血清sTLR4水平顯著高于腺癌患者。在血清sTLR4水平高組的NSCLC患者的平均總存活數(shù)顯著高于sTLR4低組，證明血清sTLR4高預(yù)示癌癥預(yù)后良好。

探究結(jié)直腸癌的新型治療方法時(shí)，發(fā)現(xiàn)sTLR4/MD-2復(fù)合物可在體外和體內(nèi)試驗(yàn)中通過(guò)下調(diào)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(IncRNA)H19表達(dá)來(lái)抑制結(jié)直腸癌的遷移和侵襲[26]。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤患者的血清中，sTLR4的濃度顯著高于正常人，而且多發(fā)性骨髓瘤不同時(shí)期的血清sTLR4濃度也有差異，Ⅱ期組血清sTLR4 濃度顯著高于Ⅰ期組，Ⅲ期組血清sTLR4 濃度顯著高于Ⅱ期組，表明血清sTLR4濃度檢測(cè)可用于多發(fā)性骨髓瘤的早期診斷[27]。

3 總結(jié)

sTLR4作為T(mén)LR4的負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制之一，在炎癥反應(yīng)中水平顯著升高，因而能作為炎癥反應(yīng)的生物標(biāo)志物。然而，sTLR4在鑒別感染性炎癥與非感染性炎癥以及細(xì)菌性感染與病毒性感染時(shí)的準(zhǔn)確性并不能超過(guò)超敏C反應(yīng)蛋白[8]，因而只能作為鑒別炎癥類型的輔助診斷手段。而且，腦脊液中的sTLR4釋放延遲，會(huì)對(duì)炎癥的及時(shí)診斷產(chǎn)生影響。在研究羅素伐他汀對(duì)于未治療的HIV患者的免疫活化標(biāo)志物的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIV患者血清sTLR4與正常人相比無(wú)顯著差異[28]，這與其他研究有很大差異，sTLR4作為炎癥標(biāo)志物的準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

sTLR4在結(jié)構(gòu)上與TLR4胞外域極為相似，可競(jìng)爭(zhēng)性抑制細(xì)胞膜上TLR4與其配體結(jié)合，因而能阻斷TLR4信號(hào)通路，從而抑制相關(guān)配體引起的炎癥反應(yīng)。但是sTLR4單獨(dú)并不能結(jié)合LPS等配體，必須要與單體MD-2形成復(fù)合物才能與細(xì)胞膜表面TLR4競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合配體，大劑量的MD-2很難制備，狀態(tài)不穩(wěn)定，易沉積形成大量無(wú)活性的二硫化低聚體，為sTLR4的應(yīng)用帶來(lái)了困難。此外，這些試驗(yàn)只是驗(yàn)證在體外和小鼠體內(nèi)，在其他動(dòng)物甚至人類體內(nèi)sTLR4/MD-2能否抑制炎癥反應(yīng)還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

總之，盡管存在種種限制和未知，sTLR4的發(fā)現(xiàn)意義重大，不僅能作為T(mén)LR4的一種負(fù)調(diào)節(jié)機(jī)制，還能作為炎癥的拮抗劑，抑制炎癥；作為炎癥的生物標(biāo)志物，預(yù)示體內(nèi)出現(xiàn)炎癥反應(yīng)；作為某些腫瘤的標(biāo)志物，反映腫瘤預(yù)后；代替TLR4胞外域，驗(yàn)證各種信號(hào)分子與TLR4的相互作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Nicholas DA,Zhang K,Hung C,etal.Palmitic acid is a toll-like receptor 4 ligand that induces human dendritic cell secretion of IL-1β[J].PLoS One,2017,12(5):e0176793.

[2] Iwami KI,Matsuguchi T,Masuda A,etal.Cutting edge:naturally occurring soluble form of mouse Toll-like receptor 4 inhibits lipopolysaccharide signaling[J].Immunology,2000,165(12):6682-6686.

[3] 杜金苓,韓紅兵,張寶路,等.綿羊sTLR4基因的克隆表達(dá)及定位[J].中國(guó)畜牧雜志,2011,47(9):28-30.

Du JL,Han HD,Zhang BL,etal.Cloning expression and localization of sTLR4 gene in sheep[J].Chinese Journal of Animal Science,2011,47(09):28-30.

[4] Hyakushima N,Mitsuzawa H,Nishitani C,etal.Interaction of soluble form of recombinant extracellular TLR4 domain with MD-2 enables lipopolysaccharide binding and attenuates TLR4-mediated signaling[J].Immunol,2004,173(11):6949-6954.

[5] Mitsuzawa H,Nishitani C,Hyakushima N,etal.Recombinant soluble forms of extracellular TLR4 domain and MD-2 inhibit lipopolysaccharide binding on cell surface and dampen lipopolysaccharide-induced pulmonary inflammation in mice[J].Immunology,2006,177(11):8133-8139.

[6] Zou Y,Qin F,Chen J,etal.sTLR4/MD-2 complex inhibits colorectal cancer in vitro and in vivo by targeting LPS[J].Oncotarget,2016,7(32):52032-52044.

[7] Zunt SL,Burton LV,Goldblatt LI,etal.Soluble forms of Toll-like receptor 4 are present in human saliva and modulate tumour necrosis factor-alpha secretion by macrophage-like cells[J].Clin Exp Immunol,2009,156(2):285-293.

[8] Ten Oever J,Kox M,van de Veerdonk FL,etal.The discriminative capacity of soluble Toll-like receptor (sTLR)2 and sTLR4 in inflammatory diseases[J].BMC Immunol,2014,15:55.

[9] Barreto G,Sandelin J,Salem A,etal.Toll-like receptors and their soluble forms differ in the knee and thumb basal osteoarthritic joints[J].Acta Orthopaedica,2017,88(3):326-333.

[10] Mothapo KM,Ten Oever J,Koopmans P,etal.Soluble TLR2 and 4 concentrations in cerebrospinal fluid in HIV/SIV-related neuropathological conditions[J].J Neurovirol,2017,23(2):250-259.

[11] Kacerovsky M,Andrys C,Hornychova H,etal.Amniotic fluid soluble Toll-like receptor 4 in pregnancies complicated by preterm prelabor rupture of the membranes[J].Matern Fetal Neonatal Med,2012,25(7):1148-1155.

[12] Brandl K,Glück T,Hartmann P,etal.A designed TLR4/MD-2 complex to capture LPS[J].J Endotoxin Res,2005,11(4):197-206.

[13] Raghavan B,Martin SF,Esser PR,etal.Metal allergens nickel and cobalt facilitate TLR4 homodimerization independently of MD2[J].EMBO Reports,2012,13(12):1109-1115.

[14] Chang RS,Wang YC.Soluble toll-like receptor 4 reversed attenuating effect of Chinese herbal Xiao-Qing-Long-Tang on allergen induced nerve growth factor and thymic stromal lymphopoietin[J].Exp Therap Med,2013,6(5):1199-1207 .

[15] Wang M,Wang F,Yang J,etal.Mannan-binding lectin inhibits Candida albicans-induced cellular responses in PMA-activated THP-1 cells through Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4[J].PLoS One,2013,8(12):e83517.

[16] Zhu C,Bao NR,Chen S.HBD-3 regulation of the immune response and the LPS/TLR4-mediated signaling pathway[J].Exp Therap Med,2016,12(4):2150-2154.

[17] Teghanemt A,Weiss JP.Radioiodination of an endotoxin·MD-2 complex generates a novel sensitive,high-affinity ligand for TLR4[J].Innate Immunity,2013,19(5):545-560.

[18] 孟曉燕，張國(guó)俊，楊 燦，等.TLR4 基因敲除對(duì)小鼠內(nèi)臟脂肪組織免疫細(xì)胞及脂肪因子的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2017，33 (5):665-667.

Meng XY,Zhang GJ,Yang C,etal.The effects of TLR4 gene knockout on the immunocyte and adipokines of visceral adipose tissue in mice[J].Chin J Immunol,2017,33(5):665-667.

[19] SokB,Wsik N,Jankowski R,etal.Correction:soluble toll-like receptors 2 and 4 in cerebrospinal fluid of patients with acute hydrocephalus following aneurysmal subarachnoid haemorrhage[J].PLoS one,2016,11(6):e0157853.

[20] Cengiz M,Ozenirler S.Role of serum toll-like receptors 2 and 4 in non-alcoholic steatohepatitis and liver fibrosis[J].J Gastroenterol Hepatol,2015,30(7):1190-1196 .

[21] Akbal E,Ko?ak E,K?klü S,etal.Serum Toll-like receptor-2,Toll-like receptor-4 levels in patients with HBeAg-negative chronic viral hepatitis B[J].Viral immunology,2017,30(4):278-282.

[22] Haricharan S.TLR4 has a TP53-dependent dual role in regulating breast cancer cell growth[J].Proc Nat Acad Sci U S A,2015,112(25):E3216-E3225.

[23] Che F,Yin J,Quan Y,etal.TLR4 interaction with LPS in glioma CD133+cancer stem cells induces cell proliferation,resistance to chemotherapy and evasion from cytotoxic T lymphocyte-induced cytolysis[J].Oncotarget,2017,8(32):53495-53507.

[24] Wei F,Yang F,Li J,etal.Soluble Toll-like receptor 4 is a potential serum biomarker in non-small cell lung cancer[J].Oncotarget,2016,7(26):40106-40114.

[25] Wang K,Wang J,Wei F,etal.Expression of TLR4 in non-small cell lung cancer is associated with PD-L1 and poor prognosis in patients receiving pulmonectomy[J].Front Immunol,2017,8:456.

[26] Liang W,Zou Y,Qin F,etal.sTLR4/MD-2 complex inhibits colorectal cancer migration and invasiveness in vitro and in vivo by lncRNA H19 down-regulation[J].Acta biochimica et biophysica Sinica,2017:1-7.

[27] 張慎鋒,王 濤.血漿可溶性Fas水平和Toll樣受體4在多發(fā)性骨髓瘤的早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)(上旬刊),2013,(10):5457-5458.

Zhang SF,Wang T.The application value of plasma soluble Fas level and Toll-like receptor 4 in the early diagnosis of multiple myeloma[J].China Health Care Nutri,2013,(10):5457-5458.

[28] Weijma RG,Vos ER,Ten Oever J,etal.The effect of rosuvastatin on markers of immune activation in treatment-naive human immunodeficiency virus-patients[J].Open Forum Infect Dise,2016,3(1):ofv20.