淫羊藿苷對高糖培養條件下大鼠骨髓基質細胞Shh通路的影響

李春梅 王 馨 吳麗春 康立勛 李海清 馬晟利

(黑龍江省醫院口腔科，黑龍江 哈爾濱 150001)

2型糖尿病(T2DM)占糖尿病患病人群的93.7%〔1〕。糖尿病是代謝性疾病，由于長期胰島素分泌缺陷或者胰島素功能缺陷導致以高血糖為特征的一種系統性疾病〔2〕。淫羊藿苷是一種傳統的補益中藥，其性味辛、甘、溫，體現出強筋骨、補腎陽、祛風濕等各方面的作用。在臨床上被廣泛用于骨折、骨代謝相關的多種疾病的治療中，已取得了顯著療效〔3〕。Shh信號通路可以調控一些成骨相關因子的表達，如骨形成蛋白(BMP)22、BMP27、骨橋蛋白(OPN)、骨鈣素(OCN)等〔4〕，因此在調控軟骨形成、骨形成、骨骼發育、異位成骨發揮重要作用。有學者〔5〕將外源性Shh基因轉入實驗性糖尿病大鼠體內，發現Shh基因對大鼠的微血管重塑、創口愈合等方面都有一個明顯的促進，說明Shh信號通路激活可以改善糖尿病大鼠的軟組織愈合。 Shh是一種典型的分泌蛋白，在體內有較高的表達。合成后將會自我水解并形成C-片段和N-片段。其中N-片段的C-末端受到外部環境刺激而和膽固醇相結合，共同構成活性空間結構。一般情況下，只有在Shh存在的狀態下，補丁基因(PTCH)才能夠順利的和光滑基因(SMO)結合，從而產生對傳導通路的抑制作用。Shh影響之下，兩者相結合，從而客觀上消除了PTCH對SMO的抑制作用。Shh信號通路是一個多功能的信號通路，不但可以調控軟骨形成、骨形成、骨骼發育、異位成骨等，還可以促進糖尿病大鼠的軟組織愈合，使得血管重塑，創口愈合時間降低。本探討淫羊藿苷在高糖培養環境下，對大鼠骨髓基質細胞Shh信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1動物、試劑及儀器 取100 g左右雄性SD大鼠3只，頸椎脫臼處死。傳三代培養，獲得骨髓基質細胞〔4〕。Super M-MLV 反轉錄酶、高純總RNA快速提取試劑盒RNase固相清除劑、Powder瓊脂糖、50×TAE2×Power Taq PCR MasterMix(武漢博士德生物工程有限公司)。超速冷凍離心機(湖南湘儀)，微量移液器(BIOHIT)，真空干燥箱(SYSBERY)，紫外分光光度計(Thermo)，熒光定量PCR儀(BIONEER)。

1.2實驗方法 實驗分為：正常組(2%胎牛血清+DMEM培養的細胞)，高糖組(2%胎牛血清+高糖-DMEM培養的細胞)，淫羊藿苷組1(2%胎牛血清+DMEM+淫羊藿苷培養的細胞)，淫羊藿苷組2(2%胎牛血清+高糖-DMEM+淫羊藿苷培養的細胞)。取各組細胞提取總RNA,反轉錄得到cDNA。利用韓國BIONEER公司生產的ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析。按照實驗方法中的步驟進行RNA提取，并利用紫外分光光度計對提取的RNA濃度進行測定。本實驗每種樣本每個基因進行4個復孔平行實驗，實驗數據的選取，是舍去誤差較大的數值，取剩余數值的平均值作為最終實驗保留數據。利用2-△△CT方法分析數據，以正常組為1。

1.3統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

淫羊藿苷組1 PTCH1(1.82±0.03)和SMO(1.50±0.07)基因表達明顯高于其他組，淫羊藿苷組2 PTCH1(1.44±0.02)和SMO(1.20±0.05)基因表達分別明顯高于高糖組(0.74±0.04，0.71±0.05)和正常組(1.00±0.03，1.00±0.02)，說明淫羊藿苷增強高糖環境下骨髓基質細胞的Shh信號通路表達能力。

3 討 論

糖尿病可引發骨代謝異常，進而導致多種糖尿病骨病(比如，骨量下降、骨折率上升等)。口腔骨丟失會對患者產生兩種重要影響，其一為牙齒存留，其二為義齒修復〔6〕。此外，糖尿病可引發牙槽骨喪失，還會導致黏膜損傷，所以患者往往都對修復治療無法忍受。當糖尿病患者人數逐漸上升，而相關醫療水平也日益提升時，糖尿病治療亦日趨復雜化。糖尿病與牙周病之間存在一種雙向調節關系。當人發生急性感染后，其內分泌狀態及其代謝狀態都會發生變化，因此血糖控制很差，所以牙周感染會對糖尿病患者造成影響，使其無法很好地控制血糖。有鑒于此，糖尿病治療應注重牙周病的防治，否則可增加治療難度。但在現實生活中，口腔醫生對于糖尿病所引發的口腔并發癥往往是較為忽視的。此外，對于糖尿病患者而言，維護口腔健康是一件十分重要的事情，假如牙科醫生不能充分重視這一點，那么口腔健康也無法得到保障〔7〕。不過，對糖尿病患者口腔疾病的診療維護需要有足夠的糖尿病知識作后盾，而口腔科醫生在這方面最為欠缺，這些都是亟待解決的。淫羊藿苷是中醫治療骨質疏松最常用的藥物之一。作為淫羊藿的精華部分，淫羊藿苷在近年來被廣泛應用于成骨、破骨細胞的干預研究中〔8〕。本研究結果說明高糖可以抑制Shh信號通路的激活，而高糖同時可以抑制骨髓基質細胞的成骨，淫羊藿苷則能增強高糖環境下Shh信號通路的激活。

4 參考文獻

1靳思思，胡潔芬，吳 文.Shh在雷奈酸鍶促進骨髓間充質干細胞成骨分化過程中的作用〔J〕.中國病理生理雜志，2014；12(1)：159-64.

2李 麗，蒙秋蓉，郭 琦，等.Shh信號參與調控BMP9誘導的間充質干細胞成骨分化〔J〕.中國生物工程雜志，2014；9(1)：9-15.

3李 麗，董 謙，馮巧靈，等.Shh促進BMP9誘導的小鼠間充質干細胞C3H10T1/2的成骨分化〔J〕.基礎醫學與臨床，2014；12(21)：1629-34.

4李 麗，歐欣穎，吉彩霞，等.激活Shh信號通路促進BMP9誘導小鼠成肌細胞C2C12向成骨分化〔J〕.中國生物化學與分子生物學報，2015；5(6)：481-8.

5陳美玲，宋 珂，黃夢琪，等.Shh修飾骨髓間充質干細胞與不同骨移植材料復合的體外觀察〔J〕.臨床口腔醫學雜志，2011；3(10)：138-40.

6宋 珂，饒念靜，陳美玲，等.bFGF及Shh時序傳遞促進骨再生的實驗研究〔J〕.中國口腔種植學雜志，2011；16(1)：11-2.

7陳群力，周淑琴，須 冰，等.高效液相色譜法同時測定大黃靈脾顆粒中丹酚酸B和淫羊藿苷的含量〔J〕.安徽醫藥，2016；21(1)：46-9.

8張 攀，史 娟，劉 力，等.淫羊藿苷及其衍生物的抗氧化活性研究〔J〕.中國食品添加劑，2016；14402(5)：85-8.