中藥誘導骨髓間充質干細胞成軟骨及成骨分化的研究進展*

潘慧欣，崔元璐

（天津中醫藥大學中醫藥研究院，天津 300193）

骨髓間充質干細胞（BMSCs）是存在于骨髓中的一種非造血功能的干細胞，具有強大的自我更新能力、多向誘導分化能力，兼具多器官歸巢能力及免疫原性低的優勢，在組織工程和再生醫學領域作為種子細胞具有廣闊的應用前景，有望為臨床上難以治愈的骨科疾病提供新的治療策略。近年來，隨著對BMSCs研究的深入，其在慢性骨科疾病治療中的前景越發突顯出來。以往研究中多采用一些化學物質及細胞因子，對BMSCs誘導分化，但由于價格昂貴和安全性問題而無法廣泛應用于臨床實踐中。研究者把目光瞄準傳統中藥，選擇具有滋補肝腎、活血化瘀、補氣養血等功效的中藥及其有效成分作為誘導劑，嘗試利用中藥對BMSCs進行誘導分化并取得了良好的效果，筆者就中藥誘導BMSCs成軟骨分化和成骨分化兩個方面進行綜述，以期為骨科疾病的防治研究提供參考。

1 中藥誘導BMSCs成軟骨分化

1.1 中藥復方誘導BMSCs成軟骨分化 中藥復方多成分、多靶點、多機制的特點給中藥復方的藥理研究增加了難度，血清藥理學的提出為中藥復方的研究提供了新的思路。中藥復方應用于誘導BMSCs成軟骨分化的研究，涉及軟骨相關標志物的表達分析及信號通路的機制研究，主要涉及兩個方面。

1.1.1 中藥復方直接加入細胞培養體系中的研究 透骨消痛方（劑量200 μg/mL）在轉化生長因子-β1（TGF-β1）協同條件下可誘導體外培養的大鼠BMSCs成軟骨分化，其作用機制與活化Indian hedgehog（IHH）信號通路有關[1]。

1.1.2 中藥復方制備成含藥血清應用于BMSCs成軟骨分化的研究 研究發現右歸飲含藥血清促進大鼠BMSCs成軟骨分化的機制與抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路的4個關鍵基因MAPK13，MAPK14，腫瘤壞死受體相關因子6（TRAF-6）和MAP3K7中的某個或全部基因的表達，上調miR-24-3p的表達，阻斷p38 MAPK信號通路的部分通路有關[2]；透骨消痛顆粒含藥血清可誘導體外培養的大鼠BMSCs成軟骨分化，且效果強于軟骨誘導劑[3]；此外，龜鹿二仙湯含藥血清也可誘導兔BMSCs成軟骨分化[4]。

1.2 中藥提取物誘導BMSCs成軟骨分化 中藥提取物在質量控制方面較中藥復方更有優勢。其應用于BMSCs成軟骨分化的研究主要是關于軟骨功能表達及參與的信號通路的機制研究。主要分兩方面。

1.2.1 中藥提取物制備成含藥血清應用于BMSCs成軟骨分化的研究 牛膝提取物含藥血清可上調轉錄因子 SOX9，蛋白聚糖（Aggrecan），Ⅱ型膠原（collagenⅡ）mRNA和蛋白表達，證明其可誘導體外培養的兔BMSCs成軟骨分化[5]；5%雪蓮花醇提取物可上調collagenⅡ和Aggrecan mRNA表達，對大鼠BMSCs成軟骨分化有促進作用[6]。

1.2.2 中藥提取物直接加入細胞培養體系中的研究 應用骨碎補提取液、熟地黃提取液分別對體外培養的大鼠BMSCs進行成軟骨分化誘導，發現骨碎補提取液可促進collagenⅡ表達，而熟地黃提取液則不能[7]；中華眼鏡蛇毒液中提取出來的神經生長因子對體內軟骨損傷修復和體外培養的兔BMSCs成軟骨分化均有促進作用，其促進BMSCs成軟骨分化機制與酪氨酸激酶A（TrkA）激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（Akt）和 MAPK/細胞外調節蛋白激酶（ERK）信號通路有密切的關系[8]。

1.3 中藥單體誘導BMSCs成軟骨分化 中藥單體較單味中藥或中藥復方成分單一，純度更高，更利于進行精準的分子機制研究。應用于BMSCs成軟骨分化的中藥單體，涉及軟骨相關標志物表達的研究及軟骨功能相關基因表達的研究，少有關于信號通路的機制研究。主要為中藥單體直接加入到細胞培養體系的體外研究，按其化學成分綜述如下。

黃酮類化合物：低濃度柚皮苷與經典誘導液聯合應用于體外培養的大鼠BMSCs成軟骨分化，可明顯增加糖胺聚糖（GAG）的分泌量，而柚皮苷單獨使用時并不能促進BMSCs成軟骨分化，說明柚皮苷對經典誘導劑促進大鼠BMSCs成軟骨分化具有協同作用[9]；淫羊藿苷可顯著上調collagenⅡ、Aggrecan的表達，證實淫羊藿苷可促進大鼠BMSCs成軟骨分化[10]，且淫羊藿苷的誘導效果比單純軟骨誘導劑更好，不會使BMSCs在軟骨分化過程中肥大化[11]；淫羊藿素能促進生長分化因子-5（GDF-5）誘導大鼠BMSCs成軟骨分化，其作用機制可能與Wnt/βcatenin信號轉導通路密切相關[12]。萜類及多酚類化合物，考察白術的活性成分三環倍半萜和轉化生長因子（TGF-β1）與茶黃素聯合應用誘導體外培養的人BMSCs成軟骨分化作用，都應用到了甲苯胺藍染色法、collagenⅡ免疫組化染色法，結果均呈陽性，證明二者皆有促進BMSCs成軟骨分化的作用[13-14]。多肽類化合物，鹿茸多肽可提高GAG含量、上調collagenⅡ的mRNA表達，進而促進體外培養的兔BMSCs成軟骨分化[15]。

2 中藥誘導BMSCs成骨分化

2.1 中藥復方誘導BMSCs成骨分化 應用于誘導BMSCs成骨分化的中藥復方，涉及成骨相關標志物表達的研究、成骨相關基因及蛋白的表達和相關信號通路的機制研究。主要分為以下兩個方面。

2.1.1 中藥復方直接加入細胞培養體系中的研究 梁祖建等研究補腎調肝方水提液（劑量1mg/mL）對體外培養的大鼠衰老BMSCs成骨分化的影響，發現其可使礦化鈣結節數量明顯增多，提示補腎調肝方可促進衰老BMSCs成骨分化[16]。中藥生肌液也可促進體外培養的兔BMSCs成骨分化，且1：20生肌液組誘導效果最佳[17]。

2.1.2 中藥復方制備成含藥血清應用于BMSCs成骨分化的研究 補腎填精方（又稱骨康方）可誘導體外培養的大鼠及小鼠BMSCs成骨分化，其促進BMSCs成骨分化的機制與多條信號通路有關，可使成骨標記物Runt相關轉錄因子2（RUNX2）及p38、激活轉錄因子（ATF-2）蛋白及基因表達上調，提示其作用機制與激活p38信號通路有關[18]，可顯著上調Wnt/β-catenin信號通路主要蛋白β-連環蛋白、低密度脂蛋白受體相關蛋白5、T細胞因子的表達，提示其作用機制與Wnt/β-catenin信號通路密切相關[19]；研究發現左歸丸含藥血清可促進大鼠BMSCs成骨分化[20]，可使成骨相關基因表達上調，而基因甲基化率下調，提示其作用機制與去甲基化的表觀遺傳調控機制相關[21]；青娥方含藥血清可提高ALP活性、上調TGF-β1 mRNA表達，促進分離自絕經后骨質疏松癥的小鼠BMSCs成骨分化[22]。

2.2 中藥提取物誘導BMSCs成骨分化 應用于誘導BMSCs成骨分化的中藥提取物，多為植物藥提取物，具體分述如下。

巴戟天多糖可促進大鼠BMSCs成骨分化，其作用機制可能與激活p38 MAPK信號通路有關[23]；牛膝提取物可通過核因子κB受體活化因子/核因子κB受體活化因子配體/骨保護素（RANKL/RANK/OPG）信號通路的調節預防激素引起的激素性股骨頭壞死，減輕激素誘導的骨退化，側面說明牛膝提取物可促進小鼠BMSCs成骨分化[24]。升麻提取物也可促進體外培養的大鼠BMSCs成骨分化，其機制與雌激素受體/一氧化氮/環磷酸鳥苷（ER/NO/cGMP）信號通路有關[25]。杜仲醇提取物可促進大鼠BMSCs成骨分化，其作用機制主要與響應Wnt信號通路中的跨膜受體卷曲蛋白2（Fzd2）和Fzd3受體分子有關[26]。

2.3 中藥單體誘導BMSCs成骨分化 應用于BMSCs成骨分化的中藥單體，涉及成骨相關基因、蛋白表達及信號通路的機制研究。主要為中藥單體直接加入到細胞培養體系的體外研究，按中藥單體的化學成分綜述如下。

多糖類成分：黃精多糖可提高堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原氨基端肽（PINP）、骨形態發生蛋白2（BMP2）、骨涎蛋白的表達進而促進體外培養的小鼠BMSCs成骨分化[27]。醌類化合物：大黃素不僅可促進去卵巢小鼠BMSCs成骨分化，同時還能抑制其向成脂分化[28]。苯丙素類化合物：異補骨脂素可提高堿性成纖維細胞因子，胰島素樣生長因子-1，Osterix和RUNX2的mRNA表達來促進BMSCs成骨分化[29]。黃酮類化合物：包括金雀異黃酮、淫羊藿總黃酮、淫羊藿苷、淫羊藿次苷和槲皮素。金雀異黃酮促進小鼠BMSCs成骨分化的機制可能與激活p38 MAPK信號通路有關[30]。淫羊藿總黃酮含藥血清可促進人及大鼠BMSCs成骨分化，其作用機制與BMP和Wnt/β-catenin信號通路相關[31]；淫羊藿苷可促進大鼠、山羊及人BMSCs成骨分化，且作用機制與BMP-2，OCN，Osterix和RUNX2mRNA表達上調有關[32-33]；淫羊藿苷成骨能力，與淫羊藿次苷Ⅱ比較，淫羊藿次苷Ⅱ誘導效果更佳，其促進大鼠BMSCs成骨分化的機制與激活雌激素信號通路有關[34]；槲皮素促進大鼠BMSCs成骨分化的作用機制與激活ERK1/2和c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號通路或ERK和p38信號通路有關[35-36]。多酚類化合物：白藜蘆醇可通過抑制NF-κB信號通路來保護由TNF-α引起的小鼠BMSCs成骨分化抑制[37]。

3 問題與展望

目前，中藥誘導BMSCs成軟骨及成骨分化的研究已取得了相當多的成果，但仍存在一些亟待解決的問題。首先，除中藥單體外，復方中藥及中藥提取物成分復雜，需進一步確定具誘導分化作用的有效成分，含藥血清成分也很復雜，且目前缺乏制備含藥血清的標準操作規程和質量控制體系。其次，目前將中藥復方直接加入細胞培養體系用于誘導BMSCs成軟骨及成骨分化的體外研究較少，缺少文獻支持，導致一些研究的給藥劑量可能過大[1，16]。在實際臨床應用中，受藥物本身生物利用度及首過效應影響，通過口服方式在體內的血藥濃度無法達到體外研究選擇的劑量，對骨科疾病的防治沒有實際意義。另外，中藥誘導BMSCs成軟骨及成骨分化機制復雜，目前對于發揮作用的相關信號通路分子機制研究較少。未來研究應更多地結合藥代動力學、轉錄組學、蛋白組學等現代研究手段，深入探明中藥誘導BMSCs成軟骨及成骨分化過程中發揮作用的有效成分以及機制通路和作用靶點，為中藥應用于誘導BMSCs分化治療骨科疾病提供更可靠的依據。