PCR方法檢測豬病料的注意事項

張文通 魏 鳳李 峰王金良 苗立中沈志強,

（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州 256600；2山東省濱州畜牧獸醫研究院，山東濱州 256600）

隨著規模化養殖加速發展，豬病變得極為復雜，僅靠傳統診斷效果并不理想。目前從事豬病實驗室檢測服務的單位主要有農業高校或科研院所、飼料廠或獸藥廠、規模養豬場及剛剛興起的“第三方”專業檢測機構等[1-4]。這些服務機構在檢測豬病病原時使用最多的方法是PCR方法。PCR方法因其特異、敏感、快速等優點，獲得檢測人員的高度認可。但在應用PCR方法過程中，如果操作不規范，就會出現“假陽性”或“假陰性”等錯誤結果，從而誤導豬場防疫工作[5-8]。本文對應用PCR方法檢測豬病臨床病料的一些注意事項進行了概述，以期為檢測人員規范操作提供參考。

1 PCR方法介紹

聚合酶鏈式反應，PCR（Polymerase Chain Reaction），是一種體外DNA擴增技術，由高溫變性、低溫退火（復性）及適溫延伸等反應組成一個周期，循環進行，使目的DNA得以迅速擴增，從而在短時間內獲得所需的大量特定基因片段。目前常用的豬病病原PCR檢測方法包括普通RCR或RT-PCR、多重PCR或RT-PCR、套式PCR或RT-PCR及實時熒光定量PCR等。

2 PCR方法在臨床應用中的注意事項

2.1 對方法要求

使用PCR方法檢測某種豬病，需要依據相應的檢測標準。檢測標準有的是檢測人員或單位自建的，有的是來自參考文獻，比如文章、論文、專利或標準等。推薦應用國家或行業認可的標準檢測方法。比如檢測偽狂犬病毒的PCR方法國家標準為GB/T 18641-2002，豬圓環病毒的PCR方法國家標準為GB/T 21674-2008，鑒別豬繁殖與呼吸綜合征病毒高致病性與經典株復合RT-PCR方法國家標準為GB/T 27517-2011，豬鏈球菌2型PCR定型檢測技術國家標準為GB/T 19915.3-2005，等等。建議檢測人員按照國家或行業標準操作，檢測結果具有高度準確性或認可性。

2.2 對硬件設施要求

進行PCR試驗，需要分區操作，包括模板提取區、配液區、PCR擴增區和電泳區。要求人流及物流嚴格按照模板提取區—配液區—PCR擴增區—電泳區路線單向流動，嚴禁倒流。人流與物流通道分開，配液應在生物安全柜中進行，電泳區應有排風及污染物處理設施。這4個區域應配套專用的移液器、槍頭、工作服、手套及垃圾桶等耗材，嚴禁相互交叉使用。還需強調的是：如果做相關基因克隆、質粒提取等工作，禁止在這4個區域操作。上述所有要求都是為了防止“氣溶膠污染”。為規范操作，檢測人員應做好儀器使用、試劑領取和使用記錄。為避免頻繁反復凍融PCR試劑，如反轉錄酶、rTaq酶、引物等，可將其分裝成小份使用。對于PCR所用的槍頭，要高壓處理，如果槍頭用于提取和反轉錄RNA、還需用DEPC水處理。有條件的實驗室可做好儀器定期校準驗證工作。

2.3 對樣本要求

對樣本總的要求是新鮮、典型、適量及標識清楚等。送檢人員需要根據流行病學調查、臨床問診及剖檢結果，對病死豬或病豬病因作出一些推斷；根據推斷病原，無菌采集典型病變組織，裝入自封袋并標識清楚，放入裝有冰袋的泡沫箱以最快速度運送至送檢單位。

對于豬瘟，主要采集扁桃體、淋巴結、全血、脾、腎；對于豬繁殖與呼吸綜合征，主要采集血液、肺、脾、扁桃體、淋巴結；對于豬流行性乙型腦炎，主要采集患病仔豬或死胎兒的腦組織、腦積液和血液；對于豬細小病毒病，主要采集死胎或腎、淋巴結、性腺；對于豬偽狂犬病，主要采集淋巴結、肺、扁桃體、腦；對于豬圓環病毒2型，主要采集肺、胰臟、腎、淋巴結；對于豬口蹄疫，主要采集水泡皮、水泡液、心臟；對于豬傳染性胃腸炎，主要采集腸、腸內容物；對于豬流行性腹瀉，主要采集糞便、腸內容物；對于豬輪狀病毒病，主要采集糞便、腸內容物；對于豬巴氏桿菌病（豬肺疫），主要采集肺（帶氣管）、淋巴結；對于豬大腸桿菌病，主要采集小腸及內容物、肺臟、心臟；對于豬鏈球菌病，主要采集肝、脾、淋巴結、肺、血液；對于副豬嗜血桿菌感染，主要采集肺、腦、關節液、淋巴結；對于豬傳染性胸膜肺炎，主要采集肺、肝臟、全血、胸水；等等。

2.4 對操作要求

從事PCR檢測的操作人員一定要有質量意識。每次PCR檢測除了樣本外，一定要設置陰陽性對照；嚴格、詳細做好實驗記錄；注意在每個操作區更換工作服、鞋、口罩、手套等；在核酸提取和配液過程中，每添加1種試劑，更換槍頭；每天做完試驗，及時清場，進行消毒；注意個人防護，禁止在試驗區域飲食，禁止不穿工作服進入試驗區域，試驗過程中或結束后要用肥皂洗手等。

2.5 PCR檢測結果對后續分析要求

大多PCR檢測結果僅告訴送檢人員有無某個病原，并不能區分是野毒還是疫苗毒、強毒還是弱毒，不能區分病原的基因型。這就需要進一步對送檢陽性病料中病原基因組擴增并測序，分析該病原是野毒還是疫苗毒、強毒還是弱毒以及基因型信息，從而推測病原來源以及與疫苗毒株的同源性等，更加精準指導生產。

3 小結

PCR檢測在豬病診斷領域已得到廣泛應用。但在實踐中往往會出現同一份病料送到不同檢測單位的檢測結果并不一致的現象。提示檢測單位的PCR操作水平高低不一，究其原因可能是有些檢測單位沒有獲得國家認可的資質，沒有嚴格的質量管理體系。目前國家正在開展中國合格評定國家認可委員會（CNAS）認證和中國計量認證（CMA）工作，建議養豬場在送檢病料時，選擇有資質的機構進行檢測。