ACTN4基因184T＞A突變與兒童局灶節段性腎小球硬化的關系

柳春艷 呂慧妍 孫敏 賈玲 李錦玉 安曉霞 郝麗榮

原發性局灶節段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis，FSGS）是兒童激素抵抗性腎病綜合征的常見原因，病理特征為部分毛細血管袢小葉非炎癥硬化、足突融合消失。足細胞凋亡、脫落及上皮間質轉分化是發病的初始環節[1-2]。輔肌動蛋白4（α-actinin-4，ACTN4）由ACTN-4基因編碼的細胞骨架蛋白，有助于將肌動蛋白錨定至黏著斑以維持足細胞正常結構和功能[3-4]，而ACTN-4基因突變導致足細胞機械特性改變和骨架結構破壞而引起足細胞減少及腎小球硬化[1]。研究發現ACTN基因同義突變465C＞T[5]及雜合突變Y265H[6]可引起國外兒童原發性FSGS，但中國兒童FSGS與ACTN-4基因突變的研究較少，僅個別報道1-34C＞T變異引起散發兒童FSGS[7]，我中心前期檢測到成年FSGS患者第2外顯子區雜合錯義突變184T＞A（Ser62Thr），但該患者無后代，尚不明確此突變是否可引起兒童FSGS，因此，本研究擬明確ACTN4基因184T＞A突變與兒童原發性FSGS的關系及發生率，并尋找新致病突變。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年3月-2016年7月于黑龍江省醫院腎內科及兒科住院并經腎活檢病理檢查確診為兒童FSGS患者50例，男性29例，女性21例；年齡6～18歲，平均年齡為（11.64±3.78）歲；除外糖尿病、肥胖、系統性紅斑狼瘡、HIV感染、海洛因、藥物、反流性腎病、孤立腎、腎切除等引起的繼發性FSGS和其他繼發性腎臟病；詳細家族史調查，確保無腎病家族史。同時期選取于本院進行疫苗接種的尿常規正常、無腎病家族史的40例健康兒童作為對照組，其中男性23例，女性17例，平均年齡為（11.68±3.50）歲。本研究已獲本院倫理委員會批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 外周血細胞基因組DNA提取 采集患者及健康對照組成員的外周血樣3～5 ml，EDTA抗凝，DNA提取試劑盒和蛋白酶-鹽析法提取血白細胞DNA，DNA用氯酚法從頭發毛囊提取。

1.2.2 引物設計 ACTN4基因序列來自于GenBank（U48734），第2外顯子區引物自行設計，正向引物5'→3'：AGTTTCCTCACATCTGCCTCC，反向引物5'→3'：GTGGTCCTGGTTATCTACG。

1.2.3 PCR反應體系和條件 （1）反應體系為50 μl：10xPCR緩沖液 5 μl，MgCl2（25mmol/L）5 μl，La-TaqDNA 聚合酶（5 U/μl）0.5 μl，5 pmol/L的上、下游引物各1 μl，模板DNA1 μl，dNTP混合液（各10 mmol/L）1 μl； （2）反應條件：95℃預變性3 min，94℃變性30 s，55～60℃退火35 s，72℃延伸40～50 s，35個循環，72℃延伸5～8 min。

1.2.4 PCR產物鑒定 取1 μl產物加入5 μl 6×Loading buffer混勻后取5 μl加入1%瓊脂糖凝膠電泳20 min（電壓150 V），紫外燈下比較產物條帶和DNA marker，確定PCR產物長度正確。

1.2.5 PCR產物純化與測序 PCR產物純化回收試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號SK1141）收集純化PCR產物，用BIG dye terminator測序試劑盒、ET-terminator測序試劑盒和美國ABI 3730XL自動測序儀(美國Applied Biosystem)測序，采取重復和雙向測序的方法，保證結果準確可靠。

1.2.6 堿基序列對比及SNP數據庫搜尋 應用SeqMan軟件將測序輸出序列與模版序列比對，明確184T＞A突變是否存在；同時尋找其他堿基變異位點，通過Chromas軟件人工讀序列圖進行核實。發現堿基變異后查找SNP數據庫確認是否為單核苷酸多態性。

2 結果

2.1 ACTN4基因的非同義突變

1名FSGS患者2號外顯子區檢測到雜合錯義突變184T＞A（圖1），引起輔肌動蛋白4的第62位氨基酸由絲氨酸突變為蘇氨酸（Ser62Thr）；進一步檢測患兒父母DNA，未發現上述突變。其余FSGS患者及健康對照組未檢測到此突變，也未檢測到其他突變。FSGS患者中184T＞A（Ser62Thr）突變發生率為2.00%。

184T＞A突變者情況：女，16歲，因“雙下肢水腫半年，加重一周”入院。入院后檢查：雙下肢中度對稱性凹陷性水腫，血壓132/88 mmHg，尿常規顯示：尿蛋白3+，尿紅細胞3+，尿紅細胞129.77/HPF；24 h尿總蛋白定量3.14 g，血白蛋白23.7 g/L，血膽固醇6.92 mmol/L，血甘油三酯2.64 mmol/L，血肌酐為123.6 μmol/L。免疫學指標均正常。腎活檢光鏡結果見圖2：共12個腎小球，2個硬化腎小球，多個腎小球球囊粘連致節段性硬化，系膜細胞局灶節段性增殖，系膜基質輕度增多，系膜區輕度增寬。灶性腎小管萎縮，管腔狹窄，管腔內可見蛋白管型，重度腎間質病變，腎間質灶性增寬，灶性纖維化，可見灶性炎細胞浸潤，以單核細胞為主，動脈壁輕度增厚。免疫熒光IgG染色陰性（見圖2④），其余IgA、IgM、IgE、C4、C1q、HBsAg、HBcAg、HCV均陰性。電鏡符合FSGS表現。因此診斷為原發性FSGS。患者對激素治療反應較差，腎功能減退進展快，一年后再次入院已需透析治療。腎穿刺活檢病理學檢查結果見圖2。

圖1 ACTN4基因第2外顯子區雜合突變 184T＞A測序結果

圖2 ACTN4基因184T＞A突變患者光鏡檢查結果

表1 ACTN4的單核苷酸多肽

2.2 單核苷酸多態（single nucleotide polymorphism，SNP）

50例FSGS患者共發現5種堿基變異，全部位于2號外顯子，查詢SNP數據庫后證實均為SNP，其中rs759055242引起編碼氨基酸由精氨酸變為谷氨酰胺，rs550398621引起編碼氨基酸由亮氨酸變為纈氨酸，具體情況見表1。

3 討論

FSGS是臨床常見的原發性腎小球疾病之一，國外研究顯示，FSGS占美國兒童NS的20%，腎活檢比例的12.2%～18.7%；而國內研究顯示，FSGS約占兒童終末期腎臟病的20%，占所有原發性腎小球病的3.4%～6.6%。FSGS的臨床表現主要是大量蛋白尿，甚至呈腎病綜合征，約1/3患者發病早期即表現為高血壓，腎功不全。FSGS自發緩解率低，對激素及免疫抑制治療反應較差，若不能正確診治，超過50%的患者會在3～8年內進展至終末期腎臟病[8]。

FSGS按病因分為原發性FSGS、繼發性FSGS、家族性FSGS，確切的發病機制不明，病理變化以部分腎小球部分毛細血管襻小葉的非炎癥性硬化伴足突融合為特征，其中足細胞參與構成腎小球濾過屏障，而肌動蛋白參與組成足細胞骨架結構，負責維持足突結構和功能穩定，因此肌動蛋白異常將直接影響足細胞的生理功能，導致腎小球濾過屏障損傷，導致大量蛋白尿等NS表現。

ACTN4基因編碼的α-actinin-4屬于血影蛋白家族，廣泛表達于足突及心肺等組織中[9]，該蛋白能交聯肌動蛋白微絲，參與調節細胞形態、穩定細胞黏附及介導細胞遷移和運動，是眾多足細胞骨架蛋白中較重要的一種[1]。最初Kaplan等[3]通過研究常染色體顯性遺傳家族性FSGS患者發現ACTN4基因第8外顯子區突變可導致FSGS，盡管這些突變不能引起α-actinin-4保守區變化，但已有報道[5]證實其致病作用。隨后Weins[9]和王朝暉[10]等發現突變體 W59R、V801M、I149del、S262P、R348Q、K255E、R837Q、T259I、L316P等與FSGS相關。大多數ACTN4基因突變引起FSGS的機制是α-actinin-4與足細胞的絲狀肌動蛋白結合增多[11]，只有L316P突變型與絲狀肌動蛋白結合減少，兩種蛋白結合異常會干擾絲狀肌動蛋白聚合和解聚，從而破壞細胞骨架、影響足細胞遷移[12]，此外突變的α-actinin-4聚集于細胞膜和細胞核周圍，形成微聚體，經過泛素化而損傷泛素-蛋白酶體系統，誘導內質網應激增強，加速細胞的凋亡[1，12]。

ACTN4基因位于19q13，包含21個外顯子，既往研究[3，9，10]發現的致病突變位于第8外顯子區及第10外顯子區，且研究對象為成年家族性FSGS患者，僅有少數文獻報道ACTN4的Y265H突變[6]和1-34C＞T變異[7]引起原發性兒童FSGS。鑒于我課題組前期研究發現第2外顯子區雜合錯義突變184T＞A（Ser62Thr）可引起成年原發性FSGS，且尚無研究報道ACTN4第2外顯子區突變和兒童原發性FSGS的關系，因此收集兒童患者來研究184T＞A基因突變與原發性FSGS的關系及其發生率十分必要。

我課題組對50例兒童原發性FSGS患者及40名健康兒童的ACTN4基因第2外顯子區進行PCR擴增后做基因測序，結果發現1例攜帶雜合突變184T＞A的患者，引起編碼蛋白α-actinin-4的62位氨基酸從絲氨酸變為蘇氨酸，進一步檢測其父母DNA未檢測到相同突變，推測可能是環境因素引起ACTN4基因在生殖細胞或者胚胎時期發生突變，變異的α-actinin-4與絲狀肌動蛋白結合增多導致足細胞結構功能異常而引起FSGS。

需要注意的是，本例具有184T＞A突變的16歲女患，一年后再次入院時已進入尿毒癥期，需要透析治療，與Feng D等[4]報道的攜帶Y265H 突變兒童腎功惡化快的臨床表現類似，而與Kaplan[3]和Weins[9]報道的ACTN4基因突變介導的FSGS多數發病較晚，以成人多見且病情緩慢進展不同。184T＞A突變和文獻報道的另外兩種突變即W59R 和S262F[9，13]共同提示，ACTN4基因突變介導的FSGS并非都有相似的發病年齡和病程。此外，由于本研究未對ACTN4基因的其他外顯子區進行測序，可能導致實際引起原發性FSGS的致病突變被忽略，未來可繼續進行全外顯子檢測以發現ACTN4基因的新致病突變。此外，本研究的樣本量有限，可能導致ACTN4基因突變率計算存在誤差和偏倚。本研究同時發現5種堿基變異，均位于外顯子區，經過與SNP數據庫比對后證實為已知SNP。

綜上，50例兒童原發性FSGS患者中僅1例存在ACTN4基因突變184T＞A，該突變發生率較低，不是引起本中心兒童原發性FSGS的常見突變。

[1]Cybulsky AV，Kennedy CRJ.Podocyte Injury Associated with Mutant α-Actinin-4[J].J Signal Transduct，2011（2011）：563128.

[2]de Mik SM，Hoogduijn MJ，de Bruin RW，et al.Pathophysiology and treatment of focal segmental glomerulosclerosis: the role of animal models[J].BMC Nephrol，2013，14（1）：1-10

[3]Kaplan JM，Kim SH，North KN，et al.Mutations in ACTN4,encoding alpha-actinin-4, cause familialfocal segmental glomerulosclerosis[J].Nat Genet，2000，24（24）：251-256.

[4]Feng D，Steinke J M，Krishnan R，et al.Functional validation of an alpha-actinin-4 mutation as a potential cause of an aggressive presentation of adolescent focal segmental glomerulosclerosis:Implications for genetic testing[J].Plos One，2016，11（12）：e0167467

[5]Komatsuda A，Wakui H，Maki N，et al.Analysis of mutations in alpha-actinin-4 and podocin genes of patients with chronic renal failure due to sporadic focal segmental glomerulosclerosis[J].Ren Fail，2003，25（1）：87-93.

[6]Feng D，Krishnan R，Steinke J，et al.Functional implications of a novel point-mutation at an ACTN4 phosphorylation site[J].Faseb J，2015，29（Suppl 1）：LB732.

[7]戴勝川，王朝暉，潘曉霞，等.原發性局灶節段性腎小球硬化患者 ACTN4 基因變異和多態性 [J].中華腎臟病雜志，2008，24（2）：108-114.

[8]Tang X，Xu F，Chen DM，et al.The clinical course and longterm outcome of primary focal segmental glomerulosclerosis in Chinese adults[J].Clin Nephrol，2013，80（2）：130-139.

[9]Weins A，Kenlan P，Herbert S，et al.Mutational and biological analysis of alpha-actinin-4 in focal segmental glomerulosclerosis[J].J Am Soc Nephrol，2005，16（12）：3694-3701.

[10]王朝暉，馬駿，朱斌，等.19例家族性局灶節段性腎小球硬化的臨床研究[J].腎臟病與透析腎移植雜志，2009，18（1）：35-38.

[11]Michaud JL，Chaisson KM，Parks RJ，et al.FSGS-associated α-actinin-4 (K256E) impairs cytoskeletal dynamics in podocytes[J].Kidney Int，2006，70（6）：1054-1061.

[12]王倩，劉茂東，趙建月，等.家族性局灶節段性腎小球硬化致病基因的研究進展[J].臨床腎臟病雜志，2015，15（6）：379-382.

[13]Choi HJ，Lee BH，Cho HY，et al.Familial focal segmental glomerulosclerosis associated with an ACTN4 mutation and paternal germline mosaicism[J].Am J Kidney Dis，2008，51（5）：834-838.