過表達H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發育效率的影響

吳 霄，李 果，敖 政，石俊松，蔡更元，劉德武，吳珍芳，李紫聰

（1.華南農業大學動物科學學院/國家生豬種業工程技術研究中心，廣東 廣州 510642；2.廣東溫氏種豬科技有限公司育種部，廣東 新興 527439）

豬克隆技術已成功應用于優良種畜擴繁、轉基因動物生產等領域，但目前豬克隆胚胎發育至出生的效率只有0.3%～1%，導致豬克隆技術的效率仍然很低，這嚴重限制了豬克隆技術的發展及推廣［1］。大量研究表明，克隆效率低下的主要原因是體細胞核的表觀重編程錯誤或不完全［2］。重編程涉及大量復雜的表觀遺傳修飾，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、X染色體失活、基因組印跡等。

組蛋白甲基化是一種重要的組蛋白修飾，其主要發生在賴氨酸和精氨酸側鏈，例如H3K4me3、H3K9me3、H3K27me3這些修飾影響著基因表達的轉錄抑制或轉錄起始。目前，H3K9me3已經被發現是誘導多能干細胞（induced Pluripotent Stem Cells，iPSC）重編程的主要障礙。Soufi等［3］研究發現，許多重編程失敗的區域往往是H3K9me3的富集區域，并且通過敲除相關的組蛋白甲基轉移酶SUV39H1/2來阻斷H3K9me3，可以“顯著加速”重編程過程。在小鼠的體細胞克隆中，H3K9me3被確定是供體細胞基因組重編程的一個主要障礙，其在克隆胚胎發育早期沉默，導致克隆胚胎難以正常發育［4-5］。Matoba 等［6］通過異位表達H3K9me3去甲基化酶KDM4D去除了H3K9me3修飾，不僅可以重激活大多數的重編程抵抗區（reprogramming resistant regions，RRRs）的表達，還將小鼠克隆胚胎的囊胚率提高到84.9%。此外，Chung等［7］向小鼠克隆胚胎顯微注射人源KDM4A的mRNA，仍然可以大幅度提高（90.3%）克隆小鼠的囊胚率。

由上可知，供體細胞來源的H3K9me3是導致克隆胚胎基因沉默的一種重要表觀遺傳標記［8］。已有研究表明，豬的體細胞存在高水平的H3K9me3修飾［9］，這也可能是阻礙豬克隆胚胎發育的一個因素。目前，通過在豬克隆胚胎中去除H3K9me3修飾提高其發育效率的相關研究未見報道。鑒于豬H3K9me3去甲基化酶基因的全長序列仍未確定，本研究在豬克隆胚胎中通過異位表達鼠源KDM4B/KDM4D mRNA的方法去除H3K9me3修飾，以期提高豬克隆胚胎的發育效率。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質粒、細胞株和豬克隆胚胎 小鼠KDM4B/KDM4D-pcDNA3.1（+）真核表達載體由蘇州金唯智生物技術有限公司合成；豬胎兒成纖維細胞采自廣東溫氏食品集團華農溫氏股份有限公司水臺原種豬場；豬克隆胚胎由廣東溫氏食品集團股份有限公司研究院現代育種技術中心克隆實驗室負責提供。

1.1.2 主要試劑 細胞與胚胎免疫熒光檢測蛋白表達試劑盒購自Life Technologies公司；組蛋白H3K9me3免疫熒光所用抗體購自Abcam生物公司；體外轉錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE?T7 Kit購自 Life Technologies公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase購自Clontech公司；普通質粒DNA小提試劑盒（E.Z.N.A?Mini Plasmid Kit）、DNA 純化試劑盒（E.Z.N.A?DNA Cycle Pure Kit）；胚胎注射級水購自Sigma公司；限制性內切酶HindIII、XhoI、BamHI購自廣州昂科生物技術有限公司；溴化乙錠（Ethidium Bromide，EB）購自廣州康龍生物科技有限公司；蛋白胨（Tryptone）、酵母浸出物（Yeast Extract）、瓊脂糖（Agar）均購自北京鼎國生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 小鼠KDM4B/KDM4D基因克隆 從NCBI獲悉小鼠KDM4B（NM_172132.2）、KDM4D（NM_173433.2）基因序列，序列大小分別是3279、1 551 bp。利用質粒分析軟件，找到合適的酶切位點，將2條基因序列的編碼區序列構建至pcDNA3.1（+）雙核表達載體（圖1）。交由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，共構建了2個基因表達載體。

1.2.2 酶切鑒定 將基因合成所得的穿刺菌接種于氨芐抗性平板中，37℃培養箱中培養12～16 h。挑取數個單克隆進行培養，進行菌液PCR鑒定，鑒定出的單克隆利用DNA小提試劑盒進行質粒抽提。抽提的質粒用限制性內切酶HindIII/XhoI進行酶切鑒定。

1.2.3 KDMB/D基因體外轉錄及加poly（A）尾 利用XhoI限制性內切酶線性化表達載體KDM4B/KDM4D，再利用DNA 純化試劑盒純化回收線性化載體。然后根據轉錄試劑盒進行體外轉錄，用E. coliPoly（A） Polymerase （NEB）對產物進行加poly A反應，獲取穩定的mRNA用于后期豬克隆胚胎胞漿顯微注射。

圖1 pcDNA3.1（+）載體圖譜

1.2.4 胞漿顯微注射小鼠KDM4B/KDM4DmRNA 通過胞漿顯微注射的方法將KDM4B/KDM4DmRNA注射入克隆胚胎中，mRNA 終濃度為2 000 ng/μL，每枚胚胎注射量為10 pL，對照組為不做處理的克隆胚胎。其中KDM4B/KDM4DmRNA注射組各注射了200個克隆胚胎。對注射組和對照組胚胎進行體外培養，統計24 h的胚胎卵裂率、72 h至8細胞期的胚胎數、168 h的囊胚數及發育至囊胚期的胚胎數。同時在胚胎發育至24 h時，在注射組和對照組中分別收集10個胚胎用于胚胎的組蛋白H3K9me3甲基化表達水平檢測，KDM4B/KDM4D引物信息見表1。

表1 KDM4B/KDM4D引物序列

1.2.5 免疫熒光法檢測克隆胚胎中組蛋白H3K9me3表達水平 將收集的胚胎放入預熱的0.5%鏈酶蛋白酶中作用1 min去透明帶，然后用洗卵液洗滌3次；加入固定劑室溫孵育15 min后用洗卵液洗滌3次；加入穿孔液室溫孵育30 min后用洗卵液洗滌3次；加入封閉液4℃過夜；加入一抗稀釋液孵育1 h后用洗卵液洗滌12次；在避光條件下加入二抗稀釋液，37℃孵育1 h后用洗卵液洗滌12次；最后加入1μg/mL碘化丙啶（Propidium iodide，PI），室溫孵育10 min后用洗卵液洗滌數次。將上述染色處理的胚胎轉移到干凈的載玻片上，以胚胎所在處為中心，在蓋玻片大小范圍內的四角做4個由凡士林/石蠟油組成的柱，蓋上蓋玻片，用指甲油封片，然后在熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.6 數據處理及統計分析 基因相對表達數據分析采用2-△△CT方法計算相對表達量。體細胞克隆胚胎的體外發育數據（分裂率、囊胚率和囊胚細胞總數）用卡方檢驗進行分析，P＜0.05表示差異顯著。采用SPSS20軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 KDM4B/KDM4D基因過表達載體構建

根據小鼠KDM4B（NM_172132.2）和KDM4D（NM_173433.2）基因序列，利用質粒分析軟件查找合適的克隆位點，將KDM4B/KDM4D基因CDs序列克隆到商業化的克隆載體pcDNA3.1（+），共構建了pcDNA3.1（+）-KDM4B（8 695 bp，限制性內切酶位點為HindIII和XhoI）和 pcDNA3.1（+）-KDM4D（6 967 bp，限制性內切酶位點為HindIII和XhoI ）兩個克隆表達載體。

用限制性內切酶HindIII單酶切pcDNA3.1（+） -KDM4B 和 pcDNA3.1（+） -KDM4D 表達載體；HindIII和XhoI雙酶切pcDNA3.1（+）-KDM4B質和pcDNA3.1（+） -KDM4D表達載體，酶切鑒定顯示載體構建成功。將過表達載體進行測序，測序結果顯示載體序列正確。

2.2 KDM4B/KDM4D基因過表達載體體外轉錄

利用XhoI酶將抽提好的KDM4B/KDM4D質粒進行線性化處理，純化回收線性化載體，測定濃度，利用體外轉錄試劑盒獲得KDM4B/KDM4DmRNA并進行加尾處理，對體外轉錄獲得的mRNA進行凝膠電泳，結果（圖2）顯示KDM4B/KDM4DmRNA已成功轉錄。

圖2 KDM4B/KDM4D體外轉錄結果

2.3 胞漿顯微注射KDM4B/KDM4D mRNA對豬克隆胚胎體外發育效率的影響

2.3.1 胞漿顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA 將24 h收集的克隆胚胎抽提RNA進行q-PCR檢測KDM4B/KDM4D表達水平，結果（圖3）顯示注射組KDM4B/KDM4D基因相對表達量遠高于對照組。

在1-cell期克隆胚胎中注射去甲基化酶KDM4BmRNA ，體外培養24 h后收集胚胎，檢測組蛋白H3K9me3的表達水平，將KDM4BmRNA注射組與空白對照組克隆胚胎免疫熒光處理后，在紫外處理（Ultraviolet，UV）、生物染色處理（Biological stain，BS）下觀察處理結果。免疫熒光實驗結果（圖4，彩插三）顯示，實驗組與對照組胚胎的H3K9me3的表達水平一致，并沒有顯著差異，說明通過克隆胚胎胞漿顯微注射去人源和鼠源去甲基化酶基因mRNA的方式并不能有效去除組蛋白H3K9me3甲基化標記。

圖3 注射后24 h KDM4B/KDM4D相對表達量

2.3.2 胞漿顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA豬克隆胚胎體外發育效率的變化 在1-cell期，對已激活的胚胎胞漿中顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA后，培養觀察克隆胚胎的體外發育情況。統計克隆胚胎體外發育的卵裂率、囊胚率、囊胚細胞數等體外發育效率。結果（表2）表明，在1-cell期激活的胚胎胞漿中顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA的實驗組與空白對照組比較，卵裂率、囊胚率沒有顯著變化；囊胚細胞數：KDM4B實驗組與對照組相比顯著提高，KDM4D實驗組與對照組相比沒有明顯變化。對168 h的囊胚進行hocesst33342細胞染色，統計其囊胚細胞數，染色結果見圖5（彩插三）。

表2 豬克隆胚胎體外發育效率結果

3 討論與結論

通過向體外轉錄的KDM4 mRNA顯微注射入克隆胚胎來提高克隆效率的研究方法已經在小鼠上獲得了成功［6-7］。Fukuda 等［10］也成功利用了KDM4B有效去除小鼠克隆胚胎的H3K9me3修飾，激活其所結合的RNF12基因和Xm-Xist的表達，使克隆胚胎發育效率得到提高。但該研究方法對豬克隆胚胎發育的影響鮮有報道，因此本研究向豬克隆胚胎顯微注射KDM4B/KDM4DmRNA來進行去除豬克隆胚胎H3K9me3修飾的探索。在本研究中，雖然KDM4B/KDM4DmRNA的相對定量PCR結果顯示KDM4B/KDM4DmRNA在克隆胚胎內成功表達，但是免疫熒光的結果顯示H3K9me3修飾依然大量存在，而且注射組的體外發育效率與對照組相比沒有顯著差異，這說明向豬克隆胚胎顯微注射鼠源的KDM4B/KDM4DmRNA沒能有效去除H3K9me3修飾。這可能是由于注射的是鼠源KDM4B/KDM4D的mRNA，可能無法對豬克隆胚胎中的H3K9me3修飾起作用，雖然Chung等［7］將人源的KDM4AmRNA注射入小鼠克隆胚胎的研究表明了KDM4基因存在保守性，而在本研究中，異源mRNA對豬克隆胚胎發育效率的影響沒有小鼠克隆胚胎那樣有效。

獲取豬源KDM4基因家族的完整序列，轉錄mRNA來進行顯微注射，這對豬克隆效率的提高可能是一種更加具有針對性的研究策略。本研究中的KDM4BmRNA注射組的囊胚細胞數相比對照組有顯著提高，這說明本研究仍具有進一步研究的潛力。同時，除了已報道的KDM4A/B/D，KDM4家族還包括了KDM4C、KDM4E及KDM4F等成員，這些基因在克隆效率上的運用尚未見報［11-12］。往后的研究可以對KDM4家族進行系統探索，尋找能在豬克隆胚胎發育中有效去除H3K9me3的一種或幾種去甲基化酶。

人為去除H3K9me3修飾來提高胚胎克隆效率，除了增加組蛋白去甲基化酶的表達，還可以考慮抑制H3K9me3修飾的甲基化轉移酶基因Suv39h1/h2和Setdb1的表達。Matoba等［6］通過向小鼠克隆胚胎轉染siRNA來抑制其Suv39h1/h2的表達，將囊胚率從6.7%提高到49.9%。而Chen等［13］則在研究iPSC的過程發現Setdb1在H3K9me3修飾建立中的作用大于Suv39h1/h2。除了H3K9me3，還有許多其他的組蛋白修飾在影響著克隆胚胎發育。Cervera等［14］利用曲古抑菌素A提高H4K8的乙酰化狀態，并提高了豬克隆胚胎的囊胚率（48.1%）。Huang等［15］發現H3K4me3在4-cell期和囊胚期的克隆胚胎中異常表達增加，這破壞了囊胚期H3K4me3-H3K27me3修飾的平衡，其認為這可能就是損害胚胎發育的原因之一。

克隆技術在豬的研究工作中具有重大的應用意義，如果能夠克服克隆效率低下的難題，克隆技術才能更好地應用于豬的理論研究及生產實踐中。利用高通量測序、免疫共沉淀、CRISPR/Ca9等前沿技術來揭示豬克隆胚胎中的表觀遺傳修飾圖譜，尋找供體細胞重編程中的關鍵障礙，對異常表觀遺傳修飾進行修復或糾正，仍是今后研究的重點［16-17］。本研究通過向胚胎注射體外轉錄的mRNA，過表達去甲基化酶KDM4B/KDM4D，嘗試去除豬克隆胚胎中的H3K9me3修飾，希望為今后的豬克隆技術研究應用提供理論依據。

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