黃鱔和泥鰍感染顎口線蟲的分類鑒定研究

黃燕瓊，鄧 艷，張 森，何淑華，戴 金，柏建山

（1.廣州機場出入境檢驗檢疫局/國家水產品檢測重點實驗室，廣東 廣州 510470；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

顎口線蟲病是一種食源性疾病，由旋尾目（spirurid）的顎口線蟲引起。當人體食入生的或未熟的感染顎口線蟲的食物后可能感染顎口線蟲，引起移行性皮下包塊和匐行疹，蟲體也可侵入人體重要器官，如肝臟、腎臟、肺臟、眼睛甚至中樞神經系，引起嚴重后果甚至死亡［1］。目前，顎口線蟲有13個有效種、5個致病種（4種分布在亞洲，1種分布在拉丁美洲）。棘顎口線蟲是亞洲地區的主要致病種，首次被發現是在倫敦動物園的老虎胃內。剛刺顎口線蟲、日本顎口線蟲和杜氏顎口線蟲病例主要發生在日本［2］，雙核顎口線蟲是拉美地區流行的唯一蟲種［3］。在墨西哥和泰國，已報道的病例均超過9 000例，日本病例4 000例［4］。

感染人體患病的主要是顎口線蟲第三期幼蟲，其宿主廣泛，其中淡水魚是顎口線蟲的重要宿主，也是感染人體的重要來源。在淡水魚中，泥鰍和黃鱔的感染率非常高，這兩種魚類在亞洲地區廣泛存在，在很多調查中，黃鱔的感染率很高［5］，在東南亞有些地區黃鱔的感染率可達100%，泥鰍中也經常發現顎口線蟲。本調查對從廣州機場口岸入境的黃鱔以及國內的黃鱔、泥鰍感染情況進行調查和分類鑒定，以期為顎口線蟲的防控提供重要的參考數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 國外蟲體來源于廣州機場口岸入境的黃鱔，進口自印度尼西亞和菲律賓。國內蟲體來源于不同地區市場所售泥鰍和黃鱔，包括廣東廣州、福建漳州、吉林長春、重慶、四川內江、湖北荊州。

1.1.2 主要儀器 生物顯微鏡（Lecia DM5000B）、體視顯微鏡（Lecia S8APO）、恒溫振蕩器（THZ-D）、冷凍離心機（Siama 3K15）、梯度PCR儀（BIOMETRA TRRADIENT） 、電泳儀（BIA-RAD、PowerPac Basic）、凝膠成像系統（VILBER）、手術刀、小鑷子、昆蟲針、載玻片、蓋玻片。

1.1.3 主要試劑 8.5 g/L生理鹽水、胃蛋白酶-濃鹽酸消化液、酒精、乳酸-酚-甘油混合透明液，試劑配制方法參照《淡水魚中寄生蟲檢疫技術規范》和《水產品中顎口線蟲檢疫技術規范》。TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒、Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒、Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒、10×PCR buffer、dNTP、Taq酶、pMD18-T載體、DH5α感受態細胞，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 顎口線蟲蟲體的分離 逐條剖開黃鱔，檢查腹腔內蟲體感染情況，再分離頭部，剪碎肌肉和肝臟后，用消化液對其進行消化，過夜消化至消化液內無明顯組織，將消化液濾過孔徑2.0 mm的篩，吸去上清液，加水攪拌后沉淀20～30 min，再吸去上清液，用清水反復清洗幾次，直至上清液透明為止，分離出蟲體，置于有生理鹽水的培養皿中。泥鰍的消化方法與黃鱔類似，但由于泥鰍個體偏小，沒有逐條進行消化，而是直接稱重，數條泥鰍一起消化。

1.2.2 蟲體的形態學鑒定 用體視顯微鏡觀察，疑似顎口線蟲的蟲體發黃，頭部有棘突，卷曲，體長一般2～5 mm，在生理鹽水中卷曲或有包囊包住，將蟲體放入乳酚透明液中，至透明后，置于載玻片上，在生物顯微鏡下觀察。觀察鑒定后將蟲體放入裝有75%酒精的離心管中-20℃保存。

1.2.3 蟲體DNA提取 將單條蟲體從75%酒精的離心管中取出，置于經滅菌的1.5 mL離心管中，用純水洗凈后用研磨棒研磨，后根據TaKaRa Universal Genomic DNA Extraction Kit試劑盒的步驟提取蟲體基因組DNA。將基因組DNA置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.4 PCR擴增ITS2序列 對顎口線蟲ITS2序列進行PCR擴增，引物信息見表1，擴增體系如下：2.5μL 10×PCR buffer，2.5μL Mg2+，1μL dNTP，1μL PE-5.8S引物，1μL PE-28S引物，0.5μLTaq酶，1μL DNA模板，用超純水補足至25μL。反應程序為：94℃預變性4 min；94℃變性 30 s、55℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，30個循環；最后72℃延伸10 min。取反應產物5μL在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳20 min，在凝膠成像系統中觀察并拍照記錄結果。

表1 對顎口線蟲ITS2序列擴增引物［6］

1.2.5 擴增片段回收克隆 使用Takara公司的Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒，按照說明書步驟進行PCR擴增片段的純化回收，將純化產物連接到pMD 18-T載體上，然后轉化至感受態細胞DH5α中培養，將DH5α感受態細胞培養液涂布到含有氨芐青霉素、IPTG、X-gal的LB瓊脂平板上，37℃恒溫培養12 h，再進行藍白斑篩選（方法參照《分子克隆實驗指南》第3版），挑取單個白色菌落，按照Takara公司的Plasmid Purification Kit Ver.4.0試劑盒說明書步驟進行質粒提取。將質粒置于-20℃冰箱保存。

1.2.6 測序、構建系統進化樹 將陽性克隆質粒送Invitrogen公司進行測序，校正處理獲得的序列，使用NCBI的BLAST在線工具進行序列比對。在GenBank中獲取不同種顎口線蟲的ITS序列，包括棘顎口線蟲（G. spinigerumn，登錄號為KP784343）、杜氏顎口線蟲（G.doloresi，登錄號為AB181156）、雙核顎口線蟲（G. binucleatum，登錄號為EU334741）日本顎口線蟲（G. nipponicum，登錄號為JQ824051）、剛刺顎口線蟲（G. hispidum，登錄號為JQ824057）、膨脹顎口線蟲（G.turgidum，登錄號為KF648548）、宮崎顎口線蟲（G. miyazakii，登錄號為FJ497055）、G. lamothei（登錄號為EU334738）、美麗筒線蟲（G. pulchrum，登錄號為AB646106）。將測序結果與下載的ITS2序列用ClustalX軟件進行差異性分析，并進行必要調整，然后用MEGA5.0（Molecular Evolutionary Genetic Analysis 5.0 version）軟件，使用最大似然法（Maximum Likelihood）構建系統發生樹，自展值（Bootstrap values）重復1000次。

2 結果與分析

2.1 廣州機場口岸入境黃鱔中顎口線蟲的檢查情況

廣州機場口岸入境的黃鱔主要來自菲律賓和印度尼西亞，這是入境水產品中唯一的一種淡水魚，對每一批次黃鱔進行抽樣調查（共19批次，其中12批次來自印度尼西亞、7批次來自菲律賓）。從表2可以看出，印度尼西亞的黃鱔感染率較高，批次陽性率達到91.7%，感染強度1～9條不等；菲律賓黃鱔中沒有發現顎口線蟲。

術后兩組患者均常規使用替硝唑片(廠家：湖南迪諾制藥有限公司，批準文號：國藥準字H43020659，規格：0.5 g)抗感染治療，劑量為1 g/次，1次/d；同時采用補佳樂(廠家：拜耳醫藥保健有限公司，批準文號：國藥準字J20171038，規格：1 mg)加黃體酮膠囊(廠家：浙江仙琚制藥股份有限公司，批準文號：國藥準字H20041902,規格：50 mg)治療，劑量分別為2 mg/次、100 mg/次，1日2次。以21 d為1個治療周期，停藥7 d后再進行下1周期治療，兩組患者均治療3個人工周期。3個月后，取出人羊膜包裹球囊和節育器，并記錄兩組患者療效。

2.2 國內部分省市市售黃鱔和泥鰍中顎口線蟲的檢查情況

2015年9～12月，對國內廣東廣州、重慶、四川內江、湖北荊州、福建漳州和吉林長春的部分市售黃鱔和泥鰍進行了檢查，只在漳州的泥鰍中發現了18條蟲體，在黃鱔中發現了1條蟲體，其他地區均無發現蟲體（表3）。因為本次檢查的時間較短、樣本有限，數據只能作為參考，需要進一步的調查。

2.3 形態學鑒定結果

在體視顯微鏡下，活體稍透明，呈黃色，頭部和尾部都向內卷曲，呈盤旋狀；死亡蟲體呈半透明，頭部伸直，尾部向頭部卷曲呈半環（圖1 A、B，彩插四）。透明后在生物顯微鏡下觀察，蟲體表面可見到體棘，約2～5 mm，向后延伸逐漸變細；蟲體可明顯分為唇部、頭球和體部3個部分，唇部向前突出，位于頭球前端；頭球表面有棘突，內部向下連接4個頸囊；食道與口唇相連，食道顏色較淺，從前端向后逐漸膨脹，在最膨大處于腸道相連，界限明顯，腸道較細，有彎曲，顏色深，長度大約是食道的1.5倍（圖1 C、D，彩插四）。

在高倍生物顯微鏡下進一步觀察，初步鑒定為3種顎口線蟲，福建漳州黃鱔中蟲體為棘

顎口線蟲，泥鰍中蟲體1條為棘顎口線蟲，17條為日本顎口線蟲，印度尼西亞黃鱔中檢出9條剛刺顎口線蟲，其余全部為棘顎口線蟲。

表2 廣州機場口岸入境黃鱔中顎口線蟲的檢查情況

（1）棘顎口線蟲：蟲體較大，體長4～5 mm，各個器官清晰可見，唇部位于頭球中央頂端，有兩對突起，共兩對頸囊，每側分布1對，食道與腸道交界如漏斗狀，尾端可見肛門和尾感器，頭球表面有棘突，呈不規則長方形，共4環棘突：第一環棘突數為40～47，第二環為37～49，第三環為42～57，第四環為42～48；頸乳突位于11～16體環處。根據這些特征初步判斷為棘顎口線蟲（圖2，彩插四）。

（2）剛刺顎口線蟲：在高倍生物顯微鏡下觀察，蟲體各部分結構符合顎口線蟲形態，頭球棘突呈不規則啞鈴型，共4環：第一環棘突數約為40，棘突數向后逐漸增加，第四環約為48；頸乳突位于9～14環體棘之間。根據以上特征初步鑒定為剛刺顎口線蟲（圖3，彩插四）。

2.4 ITS2序列PCR擴增結果

以編號為Gn-FJ1～Gn-FJ6和Gn-In1～Gn-In13的線蟲基因組DNA為模板，使用顎口線蟲ITS2通用引物PE-5.8S和PE-28S進行PCR擴增，片段約640 bp，與預期片段大小相符（圖5）。

圖5 部分顎口線蟲ITS2序列PCR產物電泳結果

2.5 序列分析

樣品測序結果經Blast分析比對，Gn-FJ5、Gn-FJ6、Gn-In1～Gn-In9、Gn-In12和 Gn-In13的ITS2序列與GenBank中已知的棘顎口線蟲（G. spinigerumn）相應基因序列（登錄號為KP784343）同源性達99%～100%；樣品Gn-FJ1～Gn-FJ4與日本顎口線蟲（G. nipponicum）同源性達99%～100%（登錄號為JQ824051）；樣品Gn-In10和Gn-In11的序列比對結果與剛刺顎口線蟲（G. hispidum）同源性達100%（登錄號為JQ824057）。

2.6 構建系統進化樹

圖 6 基于ITS2序列以最大似然法構建的系統進化樹

對19個樣品的ITS序列進行多重比對后進行必要調整，采用M-L法構建系統發生樹。從系統進化樹拓撲圖（圖6）可以看出，顎口線蟲屬對應美麗筒線蟲構成一個大分支，Gn-FJ5、Gn-FJ6、Gn-In1～Gn-In9、Gn-In12和 Gn-In13與棘顎口線蟲構成自展值為99%的獨立分支，這個分支又與雙核顎口線蟲組成一個自展值為87%分支；Gn-FJ1～Gn-FJ4與日本顎口線蟲構成自展值為90%的獨立分支；Gn-In10和Gn-In11與剛刺顎口線蟲構成自展值為98%的獨立分支，又與杜氏顎口線蟲構成一個自展值為98%的拓撲結構分支。一些可信度比較高的分支與這些蟲體的某些特性吻合，如膨脹顎口線蟲的形體是顎口線蟲中最大的，與其他蟲體形態差異明顯，在進化樹中獨立自成一支，說明其可能與其他蟲體的遺傳距離較遠；剛刺顎口線蟲和杜氏顎口線蟲的終末宿主均為豬和野豬，它們的生活史比較接近，在進化樹中，這兩個蟲種組成一個自展值為98%的分支，表明它們的遺傳距離較近；而棘顎口線蟲是亞洲地區的主要致病種，雙核顎口線蟲是美洲地區的主要致病種，兩者組成一個自展值87%的分支，說明兩者遺傳距離較近，是否與其致病性有一定關系還不得知，需要進一步研究；其他蟲種分支的自展值比較低，存在很大不確定因素，需要結合其他基因作進一步研究。

3 討論

本次從國內的黃鱔和泥鰍中發現了少量顎口線蟲，集中在福建漳州地區，187條泥鰍中發現了18條顎口線蟲，其中17條為日本顎口線蟲、1條為棘顎口線蟲，10條黃鱔中發現了1條棘顎口線蟲。雖然蟲體不多，但也說明了福建漳州地區存在顎口線蟲。購買的黃鱔和泥鰍有些是通過野生捕撈獲得，有些來自人工養殖，這對調查的結果造成一定影響。

棘顎口線蟲是世界范圍內廣泛的顎口線蟲，在歐亞、大洋洲、非洲、美洲都有發現，在我國北京、上海、江蘇、福建、廣東等10余省市均有報道，亞洲地區包括我國的絕大部分顎口線蟲病是由棘顎口線蟲引起，此次國內的檢查中在福建漳州的黃鱔和泥鰍體內各發現1條棘顎口線蟲，應該引起高度重視。

本研究在福建首次發現日本顎口線蟲，2012年李雯雯等［7］在廣州和黑龍江泥鰍中分離到日本顎口線蟲，為首次在我國本土發現日本顎口線蟲。在此之前中國出口到韓國和日本的泥鰍中有發現日本顎口線蟲［8］。本研究再一次證明我國本土存在日本顎口線蟲，在國內可能廣泛分布［9-13］，需要作進一步調查研究。

對廣州機場口岸入境的黃鱔進行檢查，印度尼西亞的黃鱔顎口線蟲感染率較高、為27.9%，而菲律賓黃鱔中沒有分離到顎口線蟲。印度尼西亞和菲律賓的黃鱔在入境時均申報為野外捕撈，在檢查中發現印度尼西亞的黃鱔大小參差不齊，體內有大量其他寄生蟲，如棘頭蟲、吸蟲、胃瘤線蟲等蟲體，說明其生長環境復雜；而菲律賓的黃鱔體型較大且均一，體內的寄生蟲很少，說明其生長環境單一。僅2016年，從廣州白云機場口岸入境的印度尼西亞黃鱔為1379.049 t，菲律賓黃鱔為802.659 t，而且黃鱔的入境數量逐年增長，尤其是現在冰鎮黃鱔等食用方法比較流行，但該方法并不能徹底殺死寄生在肌肉內的顎口線蟲，因此需要特別重視入境黃鱔的寄生蟲檢疫工作［14］。

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