同時加速溶劑萃取/氣相色譜-質(zhì)譜法測定植物中13種有機磷酸酯

羅 慶，王詩雨，孫麗娜，王 輝

(沈陽大學 環(huán)境學院 區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復教育部重點實驗室，遼寧 沈陽 110044)

有機磷酸酯(Organophosphate esters,OPEs)作為一種阻燃劑或增塑劑廣泛應用于家具家裝材料、電子設備、塑料制品以及地板拋光劑中[1]。特別是在歐美各國因多溴聯(lián)苯醚(Polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)的生物毒性和環(huán)境風險，在逐步禁止PBDEs的生產(chǎn)和使用后，OPEs在近十幾年來的生產(chǎn)量和使用量均快速增加[2-3]。但是OPEs并不安全，已有多項研究表明有機磷酸酯具有潛在的生物毒性效應，并且能在生物體內(nèi)富集[4-5]。而且OPEs主要以添加方式而非化學鍵合方式加入材料中，大多數(shù)具有半揮發(fā)性，很容易通過揮發(fā)、產(chǎn)品磨損和滲漏等方式進入到各種環(huán)境介質(zhì)中[6]。目前，對于水、土、氣等環(huán)境介質(zhì)中OPEs的相關研究正在全面開展[7-12]。但關于植物中OPEs的研究相對較少。因此，為了開展植物中OPEs的相關研究，亟需建立便捷、準確、靈敏的植物中OPEs的分析方法。

目前，OPEs的檢測主要采用氣相色譜/氮磷檢測器(GC/NPD)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)。NPD對含磷化合物具有較好的選擇性和較高的靈敏度，但存在穩(wěn)定性低和共流出等問題[13]。LC-MS對OPEs有非常好的靈敏度和特異性，但基質(zhì)干擾影響了其應用，選用電噴霧離子源(ESI)時[14]干擾尤甚。GC-MS是檢測OPEs的常用方法，但也面臨碎片離子過多、麥氏重排等問題影響靈敏度[15-16]。固體樣品中的OPEs主要采用索氏萃取、超聲萃取、振蕩萃取、微波輔助萃取或加速溶劑萃取等方法提取，然后采用硅膠、氧化鋁、弗羅里硅土或氨基鍵合硅膠(PSA)等凈化填料來凈化提取液。提取和凈化分兩步進行，不僅增加了樣品的前處理時間，也加大了有機溶劑的消耗量。

本研究基于加速溶劑萃取儀的特殊構造，將樣品的提取和凈化同時進行，并采用具有較高選擇性和靈敏度的氣相色譜-離子阱二級質(zhì)譜法檢測，建立了同時測定植物中13種OPEs的分析方法，并應用于實際樣品的分析，效果較為理想。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TRACE GC Ultra-PolarisQ 氣 相 色 譜 質(zhì) 譜 儀：配AI /AS 3000 自動進樣器，Xcalibur 1.4 工作站(美國 ThermoFisher 公司);氮氣吹掃儀(MG-2200，日本Tokyo Rikakikai公司);加速溶劑萃取儀(ASE300，美國 ThermoFisher 公司);真空冷凍干燥系統(tǒng)(FDU-1100，日本Tokyo Rikakikai公司)。

磷酸三乙酯(Triethyl phosphate，TEP)、磷酸三丙酯(Tripropyl phosphate，TPrP)、磷酸三正丁酯(Tri-n-butyl phosphate，TnBP)、磷酸三(2-氯乙基)酯(Tris-(2-chloroethyl)phosphate，TCEP)、磷酸三(1，3-二氯丙基)酯(Tris-(1-chloro-2-propyl)phosphate，TCPP)、磷酸三-(2-氯丙基)酯(Tris[2-chloro-1-(chloromethyl) ethyl]phosphate，TDCP)、磷酸丁氧基乙基酯(Tri-butoxyethyl phosphate，TBEP)、磷酸三苯酯(Triphenyl phosphate，TPhP)、磷酸二苯基-2-乙基己酯(2-Ethylhexyl diphenyl phosphate，EHDPP)、磷酸三辛酯(Tri(2-ethylhexyl) phosphate，TEHP)和磷酸三甲苯酯(Tricresyl phosphate，TCrPs)均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，磷酸三異丁酯(Tri-iso-butyl phosphate，TiBP)和三苯基氧膦(Triphenylphosphine oxide，TPPO)購自加拿大TRC公司。氘代磷酸三正丁酯(TnBP-d27)和氘代磷酸三苯酯(TPhP-d15)購自加拿大CDN公司。

正己烷、丙酮、二氯甲烷和乙酸乙酯均為色譜純，活性碳(粉末)、硅膠、弗羅里硅土、中性氧化鋁和氨基鍵合硅膠(PSA)均為分析純。硅膠和中性氧化鋁在使用前于200 ℃下活化24 h，弗羅里硅土在400 ℃下活化8 h，并用相對于凈化材料質(zhì)量比為3%的去離子水滅活。

1.2 萃取與凈化方法

植物樣品采集后冷凍保存，真空冷凍干燥后使用。

在34 mL不銹鋼加速溶劑萃取池底部放置一張纖維素濾膜，稱取5.00 g活化硅膠和5.00 g活性炭粉末先后放置于萃取池中，然后在活性炭粉末上覆蓋一張纖維素濾膜，再稱取2.00 g過1 mm篩的植物樣品置于萃取池中，之后加入20 ng內(nèi)標化合物，攪拌均勻，萃取池的剩余空間用硅藻土充滿，隨后進行加速溶劑萃取與凈化。

加速溶劑萃取條件：萃取溶劑為正己烷-丙酮(1∶1，體積比)，萃取壓力為1 500 psi，萃取溫度為100 ℃，靜態(tài)萃取時間為10 min，沖洗體積為60%池體積，氮氣吹掃時間為60 s，萃取循環(huán)次數(shù)為2次。

萃取液氮氣吹掃至近干，100 μL正己烷定容，待GC-MS/MS分析。

1.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為高純氦氣，恒流模式，流速為1 mL/min，采用脈沖不分流進樣，脈沖壓力為20 psi，進樣量為2 μL，進樣口溫度為250 ℃，色譜柱升溫程序：初始柱溫50 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至180 ℃，保持8 min，以20 ℃ /min升至240 ℃，保持8 min，以3 ℃/min升至255 ℃，再以30 ℃/min升至300 ℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：EI源(70 eV)，離子源溫度為250 ℃，連接線溫度為280 ℃，溶劑延遲時間為6 min，采用選擇反應監(jiān)測模式(SRM)。

1.4 質(zhì)量保證/質(zhì)量控制

由于OPEs的廣泛使用，避免背景污染是檢測OPEs的關鍵步驟。因此，在樣品采集、存儲、轉(zhuǎn)移和提取等過程中應避免使用塑料和橡膠制品；為了降低OPEs的光降解，采用棕色玻璃瓶。此外，所有玻璃瓶均在450 ℃下煅燒4 h并用丙酮和乙酸乙酯淋洗，錫箔紙覆蓋。為了監(jiān)測方法的背景污染，每檢測12個樣品插入1個方法空白。

2 結(jié)果與討論

2.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在全掃描模式下，對500 μg/L的OPEs標準品進行分析，通過調(diào)整色譜柱升溫程序、載氣流速和進樣模式等參數(shù)，基本實現(xiàn)了15種OPEs(13種目標化合物、2種內(nèi)標化合物)的基線分離。

在最優(yōu)的氣相色譜條件下，獲得15種OPEs的色譜保留時間，并以相對豐度高和質(zhì)量數(shù)大為標準選擇每個OPE的母離子。然后，主要優(yōu)化共振激發(fā)電壓和“q”值兩個離子阱二級質(zhì)譜參數(shù)，以獲得最優(yōu)的選擇性和靈敏度。其余的二級質(zhì)譜參數(shù)選擇默認值，隔離窗為1m/z、隔離時間為12 ms、激發(fā)時間為15 ms。

以二級質(zhì)譜圖中含有5%～10%的母離子為標準，優(yōu)化每個OPE的共振激發(fā)電壓；為了最大化子離子的豐度，優(yōu)化每個OPE的“q”值。最優(yōu)的二級質(zhì)譜條件見表1。

表1 OPEs的保留時間、母離子、子離子、“q”值、共振激發(fā)電壓和相應的內(nèi)標化合物Table 1 Retention time(RT),precursor and product ions,“q” value,resonant excitation voltage(REV) and corresponding internal standards(CIS)

2.2 萃取與凈化方法的優(yōu)化

2.2.1凈化材料與萃取溶劑的選擇由于OPEs的萃取和凈化同時進行，所選擇的萃取溶劑需要既能從植物樣品中有效萃取出目標化合物，也能從凈化材料中有效洗脫出目標化合物，同時少洗脫出干擾物質(zhì)；所選擇的凈化材料需要達到凈化目的，既能使吸附的目標化合物被萃取溶劑洗脫，也能使吸附的干擾物質(zhì)少被洗脫出。因此，凈化材料和萃取溶劑的選擇需同時進行。此外，為了在萃取池中形成有效的凈化層，本研究添加的凈化材料質(zhì)量為5 g。

植物樣品中含有大量的色素類物質(zhì)，嚴重干擾目標化合物的檢測，常規(guī)的凈化材料如硅膠、弗羅里硅土等不能有效去除這類物質(zhì)，而活性炭具有較強的吸附能力，能有效吸附色素類物質(zhì)，同時也對目標化合物具有較強的吸附作用。因此，本研究首先選用活性炭作為凈化材料，考察常用的萃取溶劑正己烷-丙酮(1∶1，體積比)、正己烷-二氯甲烷(1∶1，體積比)、二氯甲烷、二氯甲烷-乙酸乙酯(1∶1，體積比)與乙酸乙酯的萃取和凈化效果。結(jié)果表明，正己烷-二氯甲烷(1∶1)對TBEP的萃取效果較差，加標回收率僅為67.3%，并且萃取液的顏色深黃；二氯甲烷對TBEP和TEHP的萃取效果較差，加標回收率分別為62.9%和51.2%；正己烷-丙酮(1∶1)、二氯甲烷-乙酸乙酯(1∶1)和乙酸乙酯對13種OPEs的萃取效果相近，但二氯甲烷-乙酸乙酯(1∶1)和乙酸乙酯的萃取液呈深黃色，不利于GC-MS檢測，而正己烷-丙酮(1∶1)的萃取液顏色較淺且清澈。因此，選擇正己烷-丙酮(1∶1)作為萃取溶劑。

為去除植物樣品中的其它干擾物質(zhì)，本研究考察了常用的凈化材料硅膠、中性氧化鋁、弗羅里硅土、PSA以及硅膠-中性氧化鋁(1∶1，質(zhì)量比)的萃取和凈化效果。結(jié)果表明，當選用中性氧化鋁作為凈化材料時，TCEP、TPPO和TCrPs的回收率較低，分別為45.9%、45.3%和49.3%；當選用弗羅里硅土作為凈化材料時，TEHP的回收率較低，僅為57.0%；當選用PSA作為凈化材料時，TEP、TEHP和TPPO的回收率較低，分別為61.5%、62.6%和65.6%；當選用硅膠-中性氧化鋁(1∶1)作為凈化材料時，TPhP、TEHP和TCrPs的回收率較低，分別為55.1%、57.9%和60.6%；而當選用硅膠作為凈化材料時，13種OPEs的回收率較好，均大于70%。因此，選用硅膠作為凈化材料。

2.2.2加速溶劑萃取條件的優(yōu)化首先，本研究考察了萃取溫度(60、80、100、120、140 ℃)對萃取和凈化效果的影響，結(jié)果如圖1所示。當萃取溫度為140 ℃時，萃取液呈黑色，為了不影響GC-MS的性能，140 ℃條件下的萃取液未檢測。從圖1可以看出，當萃取溫度為60 ℃和80 ℃時，TPrP和TCrPs的回收率均較低，分別為66.1%、65.9%和61.6%、62.2%，其它OPEs的回收率與100、120 ℃時差異不大。當萃取溫度為100 ℃和120 ℃時，13種OPEs的回收率均無顯著差異，回收率為68.2%～91.9%，滿足痕量分析的要求；但是120 ℃時萃取液的顏色較深，并且萃取溫度越高消耗的能量越多。因此，本研究選擇萃取溫度為100 ℃。

圖1 不同萃取溫度下的萃取凈化效果(n=3)Fig.1 Recoveries of organophosphate esters at different extraction temperatures(n=3)

考察了靜態(tài)萃取時間(5、10、15、20 min)對萃取和凈化效果的影響(圖2)。結(jié)果表明，當靜態(tài)萃取時間為5 min時，僅TPrP的回收率較低，為66.2%。靜態(tài)萃取時間為10、15、20 min時，13種OPEs的回收率無顯著差異，回收率為73.7%～88.2%，滿足痕量分析的要求。因此，為了縮短分析時間，本研究選擇靜態(tài)萃取時間為10 min。

圖2 不同靜態(tài)萃取時間下的萃取凈化效果(n=3)Fig.2 Recoveries of organophosphate esters at different extraction times(n=3)

最后，本研究考察了循環(huán)次數(shù)(1、2、3次)對萃取和凈化效果的影響。結(jié)果表明，當循環(huán)次數(shù)為1次時，TEP、TCEP和TBEP的回收率較差，分別為46.3%、56.0%和51.4%。循環(huán)次數(shù)為3次時，13種OPEs的回收率與循環(huán)2次相比并未顯著增加。因此，為了減少有機溶劑的用量，本研究選擇循環(huán)次數(shù)為2次。

2.3 方法評價

2.3.1背景污染為了監(jiān)測方法的背景污染，通過多次萃取，制作空白植物樣品，并且每分析12個樣品插入1個方法空白。結(jié)果顯示，該方法的背景污染很低，低于方法檢出限。因此，在實際檢測中可忽略背景污染。

2.3.2方法的線性范圍、檢出限與定量下限選用TnBP-d27和TPhP-d15作為內(nèi)標化合物，質(zhì)量濃度均為200 μg/L，采用內(nèi)標法對13種OPEs進行定量，不同的目標化合物對應不同的內(nèi)標化合物(見表1)。

配制7個不同濃度的13種OPEs混合標準溶液進行測定，每個濃度重復3次，以目標化合物與內(nèi)標化合物的峰面積比為縱坐標、目標化合物的濃度為橫坐標，進行線性回歸分析，得到13種OPEs的線性范圍和相關系數(shù)。結(jié)果如表2所示，13種OPEs的線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99。

依據(jù)美國環(huán)保局聯(lián)邦法規(guī)法典第40部分第136節(jié)附錄B[17]計算方法檢出限。按照本方法萃取和檢測8個加標水平為5 ng/g的空白加標植物樣品，計算標準偏差。方法檢出限為3倍的標準偏差，方法定量下限為10倍的標準偏差。結(jié)果如表2所示，13種OPEs的方法檢出限為0.79～2.27 ng/g，方法定量下限為2.65～7.59 ng/g。

表2 方法的線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量下限Table 2 Linear range,correlation coefficient,method detection limit(MDL) and method quantitation limit(MQL)

2.3.3方法的回收率與精密度在植物樣品中分別添加一定濃度的13種OPEs混合標準品，加標水平分別為5、25、50 ng/g，每個水平平行測定7次，計算回收率和相對標準偏差(RSD)。結(jié)果如表3所示，13種OPEs的回收率為76.9%～113.0%，RSD為2.0%～14.6%，基本滿足痕量分析的要求。圖3為添加水平為25 ng/g的植物樣品的GC-MS/MS色譜圖。

表3 不同加標水平下方法的回收率和精密度(n=7)Table 3 Recoveries and precision of method(n=7)

圖3 添加水平為25 ng/g的植物樣品的GC-MS/MS色譜圖
Fig.3 GC-MS/MS chromatograms of 13 OPEs obtained for the spiked plant sample(25 ng/g)

2.4 實際樣品分析

采用本方法對沈陽市沈北新區(qū)某地膜上的小白菜樣品進行分析，結(jié)果顯示13種OPEs均有檢出。其中，TiBP、TnBP、TCPP、TDCP、TPhP、TBEP和EHDPP的含量分別為3.76、4.08、4.03、4.85、4.56、3.64、3.51 ng/g，TEP、TPrP、TCEP、TEHP、TPPO和TCrPs的含量均在方法檢出限與定量下限之間。圖4為該小白菜樣品的GC-MS/MS色譜圖。

3 結(jié) 論

本文建立了同時加速溶劑萃取和凈化、氣相色譜-離子阱二級質(zhì)譜檢測植物中13種有機磷酸酯阻燃劑/增塑劑的分析方法。實驗優(yōu)化了氣相色譜分離條件和離子阱二級質(zhì)譜參數(shù)，在最佳條件下的方法學評價結(jié)果表明，該方法具有較好的準確度和精密度，13種有機磷酸酯的加標回收率為76.9%～113.0%，相對標準偏差為2.0%～14.6%，檢出限為0.79～2.27 ng/g，定量下限為2.65～7.59 ng/g。該方法前處理簡單、分析時間短、有機溶劑消耗量少，可用于植物樣品中有機磷酸酯類阻燃劑/增塑劑的快速、準確檢測。

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