CSP對(duì)改善小鼠睡眠功能的研究

楊文彬，陳 磊，王 美，趙靜宇，史向華，薛潤苗，郭素萍

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原030006）

隨著社會(huì)的高速發(fā)展，生活節(jié)奏加快，工作壓力增高，失眠現(xiàn)象常有發(fā)生，成為許多人的困擾，給生活和工作帶來不便，甚至誘發(fā)其他疾病的發(fā)生，引起人們高度關(guān)注［1］。當(dāng)前在臨床上治療睡眠障礙主要依賴于鎮(zhèn)靜催眠類藥物，但長期服用所伴隨產(chǎn)生的毒副作用對(duì)患者造成潛在危害［2］。所以，從中醫(yī)藥寶庫中研發(fā)改善睡眠功能的相關(guān)產(chǎn)品備受關(guān)注，意義重大。

山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院生物工程室長期致力于冬蟲夏草菌絲的相關(guān)研究，積累了豐富經(jīng)驗(yàn)［3-5］，課題組前期以冬蟲夏草、酸棗仁、茯苓提取物為主要原料，結(jié)合中醫(yī)理論及前期基礎(chǔ)研發(fā)配置成中藥復(fù)方（簡寫為CSP）。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)CSP改善睡眠功能進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步深入研究及開發(fā)相關(guān)藥品、保健品奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，雄性，清潔級(jí)，18～22 g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（軍）2012-0004。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證書編號(hào)：SYXK（晉）2017-0001。動(dòng)物飼養(yǎng)12 h晝夜節(jié)律光照，溫度22℃～26℃，濕度40%～70%。飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號(hào)為SCXK（京）2014-0010。

1.1.2 藥品與試劑 受試物以冬蟲夏草、酸棗仁、茯苓提取物為主要原料配置而成（文中簡寫為CSP），本受試物由山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院生物工程實(shí)驗(yàn)室制備（樣品為棕黃色液體，流動(dòng)性良好，以蟲草含量計(jì)算，濃度為0.125 g/mL）；戊巴比妥鈉（pentobarbital sodium salt Merck：P11011）；巴比妥鈉（分析純，批號(hào)：20170221）；氯化鈉注射液（石家莊制藥四廠，國藥準(zhǔn)字H13023200）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)參照《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范2003》與《實(shí)驗(yàn)藥理方法學(xué)》（人民衛(wèi)生出版社，第4版），對(duì)CSP進(jìn)行改善睡眠功能實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。

本研究設(shè)計(jì)3批實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)一批進(jìn)行直接睡眠實(shí)驗(yàn)和延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)二批進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)三批進(jìn)行巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果測(cè)定在24℃～25℃安靜環(huán)境下進(jìn)行。

1.2.1 分組與給藥 每批實(shí)驗(yàn)均設(shè)CSP高、中、低3個(gè)劑量組和1個(gè)空白對(duì)照組，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分組。人用劑量為每日2.5 g/60 kg，即0.042 g/kg（以蟲草含量計(jì)算）。高、中、低劑量組分別每天灌胃劑量為人用劑量30倍（1.26 g/kg）、20倍（0.84 g/kg）、10 倍（0.42 g/kg），給藥30 d。小鼠灌胃體積為20 mL/kg，戊巴比妥鈉和巴比妥鈉腹腔注射劑量為10 mL/kg。

1.2.2 直接睡眠實(shí)驗(yàn) 觀察受試組動(dòng)物給予受試樣品，對(duì)照組給予同體積溶劑后，是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標(biāo)。當(dāng)小鼠置于背臥位時(shí)，能立即翻正身位。如超過60 s不能翻正者，即認(rèn)為翻正反射消失，進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動(dòng)物覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間，記錄空白對(duì)照組與受試樣品組入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間［6］。

1.2.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn) 為確定戊巴比妥鈉最小閾上催眠劑量與最大閾下催眠劑量，以同一批次同一飼養(yǎng)環(huán)境小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。取40只小鼠，按體質(zhì)量隨機(jī)分成4組，每組10只，按照體質(zhì)量分別腹腔注射25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液，記錄小鼠30 min內(nèi)入睡發(fā)生率［7］。其中，動(dòng)物入睡發(fā)生率100%，但又不使動(dòng)物睡眠時(shí)間過長的戊巴比妥鈉劑量作為最小閾上劑量；動(dòng)物入睡發(fā)生率10%～20%的戊巴比妥鈉劑量作為最大閾下劑量。動(dòng)物末次給藥與應(yīng)用給予溶劑及高、中、低CSP 1 h后，給各組動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉最小閾上催眠劑量，注射量為0.1 mL/10 g，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察受試樣品能否延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間。

1.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物末次給予溶劑及高、中、低CSP 1 h后，各組動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量，記錄30 min內(nèi)入睡動(dòng)物數(shù)（翻正反射消失達(dá)1 min以上者）。

1.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn) 做正式實(shí)驗(yàn)前先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定動(dòng)物100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過長的巴比妥鈉的最小閾上劑量（200～300 mg/kg），用此劑量正式實(shí)驗(yàn)［8］。動(dòng)物末次給予溶劑及高、中、低CSP 10～20 min后，給各組動(dòng)物腹腔注射巴比妥鈉，注射量為0.2 mL/20 g，以翻正反射消失為指標(biāo)，觀察受試樣品對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)處理。睡眠時(shí)間與睡眠潛伏期為計(jì)量資料，采用方差分析，方差齊，計(jì)算F值。對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)分布或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。入睡動(dòng)物數(shù)為計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

連續(xù)給予 1.26 g/kg、0.84 g/kg、0.42 g/kg 劑量的受試物及溶劑30 d后，觀察60 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)情況，在此期間各組動(dòng)物均未見翻正反射消失，且行為活動(dòng)正常。說明CSP沒有直接催眠的功能。

2.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

閾劑量篩選：不同劑量（25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg）戊巴比妥鈉使小鼠30 min內(nèi)的入睡發(fā)生率分別為20%、30%、80%、100%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量為25 mg/kg，最小閾上催眠劑量為40 mg/kg。CSP對(duì)延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響見表1、圖1。中劑量和高劑量CSP能明顯延長小鼠睡眠時(shí)間，與對(duì)照組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 CSP對(duì)延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響 （±s）

表1 CSP對(duì)延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01

組別 劑量（m g/k g） n 睡眠時(shí)間（s）對(duì)照組 0 1 2 7 8 5.0 8±2 2 9.7 1低劑量組 0.4 2 1 2 8 3 8.9 2±2 0 9.4 7中劑量組 0.8 4 1 2 1 2 4 2.0 8±2 5 1.6 2 1）高劑量組 1.2 6 1 2 1 1 6 5.9 2±2 8 8.8 5 1）

圖1 CSP對(duì)延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間的影響

2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

連續(xù)給予高、中、低劑量的受試物，小鼠睡眠發(fā)生率與對(duì)照組比較均有增加趨勢(shì)，但用χ2檢驗(yàn)計(jì)算得出差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 CSP對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠發(fā)生率的影響 （±s）

表2 CSP對(duì)閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠發(fā)生率的影響 （±s）

組別 n 入睡動(dòng)物數(shù) 入睡動(dòng)物發(fā)生率（%）對(duì)照組 1 5 2 1 3.3 0低劑量組 1 4 2 2 1.4 0中劑量組 1 5 3 2 0.0 0高劑量組 1 4 3 1 4.3 0

2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

用相同批次、相同飼養(yǎng)環(huán)境小鼠進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定動(dòng)物100%入睡，但又不使睡眠時(shí)間過長的巴比妥鈉的劑量，即最小閾上催眠劑量為300 mg/kg。

對(duì)照組及低、中、高劑量樣品組動(dòng)物睡眠潛伏期見表3、圖2。進(jìn)一步兩兩比較得出，低劑量動(dòng)物睡眠潛伏期與對(duì)照組相比均值降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中劑量組和高劑量組的動(dòng)物睡眠潛伏期與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 CSP對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響 （±s）

表3 CSP對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響 （±s）

注：與對(duì)照組比較，1）P＜0.01

組別 劑量（m g/k g） n 睡眠潛伏期（s）對(duì)照組 0 1 4 1 8 4 5.0 7±3 2 6.9 0低劑量組 0.4 2 1 4 1 6 7 7.8 6±5 8 9.5 5中劑量組 0.8 4 1 2 1 3 3 9.7 5±3 8 6.9 9 1）高劑量組 1.2 6 1 4 1 2 3 8.5 7±3 8 9.0 2 1）

3討論

圖2 CSP對(duì)巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

本文通過對(duì)CSP改善睡眠功能的研究，結(jié)果表明，CSP沒有明顯直接催眠作用，中劑量組和高劑量組均能明顯延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間和巴比妥鈉睡眠潛伏期時(shí)間（P＜0.01），根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》可說明CSP具有改善睡眠功能的作用，可作為進(jìn)一步開發(fā)理論依據(jù)。

本次實(shí)驗(yàn)研究的受試物CSP中冬蟲夏草、酸棗仁、茯苓為主要原料，吳垠等［9-10］通過光電法對(duì)正常小鼠自主活動(dòng)的影響、延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間和戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)等，進(jìn)行了蟲草菌粉有效部位的藥效研究，并采用RP-HPLC熒光檢測(cè)法測(cè)定小鼠腦內(nèi)5-HT、5-HIAA、DA、NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，探討蟲草菌粉有效部位鎮(zhèn)靜催眠的機(jī)制。結(jié)果表明蟲草菌粉有效部位有明顯減少正常小鼠自主活動(dòng)、顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間和戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間閾下劑量催眠作用，蟲草菌粉有效部位可顯著降低小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE和DA的含量；有鎮(zhèn)靜和改善睡眠作用，其作用機(jī)制可能與降低小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE和DA的含量有關(guān)。徐煜彬等［11］評(píng)價(jià)茯苓及其拆分組分的活性，采用東莨菪堿造成小鼠記憶障礙并應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，觀察茯苓及其組分對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響，同時(shí)應(yīng)用抖籠法及戊巴比妥鈉協(xié)同催眠實(shí)驗(yàn)來觀察茯苓及其組分的鎮(zhèn)靜催眠作用，顯示茯苓可改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力且具有鎮(zhèn)靜催眠作用。金陽等［12］以酸棗仁湯對(duì)失眠大鼠睡眠周期的影響進(jìn)行研究，表明酸棗仁湯對(duì)電刺激所致失眠大鼠的睡眠周期有影響，且隨著劑量的變化作用不同。

本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證CSP改善睡眠的藥理作用，為進(jìn)一步闡明該中藥復(fù)方治療失眠的理論與技術(shù)的科學(xué)內(nèi)涵提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

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