丁苯酞注射液對原代培養神經元類缺血再灌注損傷的影響

高美琳，楊 琨

（山西省中西醫結合醫院，山西太原030013）

腦卒中是目前嚴重威脅人民健康，影響人民生活質量的一種疾病，其存在著高發病率、高致死率、高致殘率、高復發率等4大特點。這其中又以缺血性腦卒中（腦梗死）為主，臨床中腦梗死的治療以溶栓、抗血小板聚集、腦保護為主。研究證實，在神經細胞損傷的過程中，神經細胞凋亡起著主要作用，尤其處在缺血半暗帶中的神經細胞，及時恢復灌注，早期進行抗細胞凋亡治療是減少神經損傷的重要一環。但在治療過程中，在改善微循環的同時，也會出現再灌注損傷，如何能夠減輕再灌注損傷，減輕神經細胞凋亡，目前臨床上有多種藥物應用。而丁苯酞氯化鈉注射液越來越受到重視。

丁苯酞氯化鈉注射液（商品名：恩必普注射液）是近年來廣泛應用于臨床的腦保護劑。現有的多項研究均證實丁苯酞注射液對腦缺血后神經損傷有著良好的保護作用。既往研究認為丁苯酞注射液可保護細胞線粒體，但是否丁苯酞注射液可進一步減輕再灌注損傷后神經細胞凋亡，從而達到腦保護作用，目前還需進一步探討。本實驗中采用體外培養大鼠原代神經元細胞，并在此基礎上誘導缺血再灌注損傷，以此為模型，觀察丁苯酞注射液在神經元保護方面所起的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 新生1 d Wistar大鼠，清潔級，體質量5 g，購于北京，動物合格證編號：SCXK（京）2012-0001。

1.1.2 試劑與儀器 流式細胞儀（BD公司），胎牛血清（GIBCO），DMEM高（無）糖培養基（GIBCO），四噻唑藍（MTT），Annexin V-FITC Apoptosis Detection KitⅠ（BD 401001），丁苯酞注射液，神經元特異性烯醇化酶（NSE）。

1.2 實驗方法

取新生1 d的Wistar大鼠3只，在無菌情況下剪斷大鼠雙側頸總動脈后放血，然后將大鼠放入75%酒精中消毒，去除腦后剝離腦膜和血管，剪碎成約1 mm3大小組織塊，然后用胰酶3 mL終止消化，靜置后棄上清液，將剩余組織吹打，過濾，離心。然后將處理過的細胞添加完全細胞培養基，并調整細胞數至合適數量，隨后用臺盼藍染色法評估細胞活性，當所檢細胞活性大于95%時，將處理好的細胞用含有10%胎牛血清的DMEM培養基種植于培養板上，每孔添加2 mL培養液，然后置于37℃、5%CO2的培養箱中培養，培養48 h后將半量培養液棄去并更換新培養液，同時在培養皿中加入阿糖胞苷以抑制膠質細胞生長。靜置24 h后棄去含有阿糖胞苷的培養液，同時更換培養液，以后每3 d更換一半培養液。細胞培養7 d后應用顯微鏡觀察培養神經元生長情況及細胞形態，并用神經元特異性烯醇化酶（NSE）鑒定培養的細胞為神經元［1］。

1.3 類缺血再灌注模型的建立

將培養7 d并鑒定為大鼠神經元的細胞，隨機分為對照組、缺血組（類缺血后再灌注）、實驗組（類缺血再灌注后加丁苯酞）。對照組正常細胞培養條件下培養，缺血組在神經元正常條件下培養7 d時，改變培養環境，用含90%氮氣的氣體替換正常空氣，同時更換培養基為無添加胎牛血清的培養基，以上條件繼續培養1 h，然后轉入對照組相同條件下繼續培養，并在1 h、12 h、24 h時分別取出細胞進行實驗；實驗組在更換為缺血組培養條件前24 h加入10 μmol/L的丁苯酞注射液作用24 h，然后同缺血組相同培養條件培養，建立實驗模型。

1.4 檢測指標

對各組神經細胞進行MTT比色分析以測定細胞存活率：分別在各組培養神經元的96孔培養板中加入MTT試劑，在37℃的CO2培養箱中作用4 h，取出后棄去上清液，將培養細胞放置于酶標儀上測490 nm波長處的吸光值（OD），用以檢測培養神經元的存活率，并且設置空白對照組。神經元凋亡率檢測：應用流式細胞儀檢測神經元凋亡率，將培養板內用于實驗的神經元細胞用胰酶消化法處理，處理時將貼壁培養細胞配置成細胞懸液，并調整細胞數目至上機數目，加入實驗管內震蕩混勻，混勻后加入磷脂酰結合蛋白V（Annexin V-FITC）及碘化丙啶（PI）10 μL，再次震蕩混勻，后避光作用20 min，上流式細胞儀進行定量檢測。并用細胞儀自帶軟件分析。

1.5 統計學方法

2 結 果

2.1 鑒定神經元細胞

取培養細胞應用免疫細胞化學方法，應用神經特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體，按實驗步驟進行免疫細胞化學染色，如細胞染為棕黃色染色則為陽性結果，通過以上方法檢測培養細胞，結果證明本實驗培養細胞為神經元細胞。

2.2 細胞活性測定

正常組的細胞活性在檢測的3個時間點差異無統計學意義（P＞0.05）。缺血組細胞活性隨著時間的延長呈現下降趨勢。隨著再灌注時間的逐漸延長，可以觀察到在再灌注12 h、24 h時，實驗組的細胞活性顯著高于缺血組，差異有統計學意義（P＜0.01）。結果見表 1。

表1 各組細胞MTT比色分析結果 （±s）

表1 各組細胞MTT比色分析結果 （±s）

注：與缺血組再灌注1 h比較，1）P＜0.01；與缺血組相應時間段比較，2）P＜0.01

組別 例數 再灌注1 h 再灌注12 h 再灌注24 h正常組 12 3.470±0.121 3.631±0.168 3.251±0.129缺血組 12 2.265±0.273 1.556±0.0151） 1.428±0.0731）實驗組 12 2.538±0.146 2.326±0.136 2.357±0.0672）

2.2 細胞凋亡率分析

用于檢測細胞凋亡率的實驗細胞經處理后，調整每管細胞，使細胞數在1×105/mL左右后，應用流式細胞儀定量分析，結果顯示正常組培養細胞在不同時間點凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；而缺血組培養細胞隨著時間的延長凋亡率逐漸增加，后一時間點高于前一時間點，24 h檢測值為最高；實驗組細胞凋亡率仍為逐漸增加，在每個相同時間點實驗組的細胞凋亡率明顯低于缺血組（P＜0.01）。結果見表 2。

3 討論

表2 各組細胞細胞凋亡率檢測結果 （±s）

表2 各組細胞細胞凋亡率檢測結果 （±s）

注：與缺血組再灌注1 h比較，1）P＜0.01；與缺血組相同時間段比較，2）P＜0.01

組別 例數 再灌1 h 再灌1 2 h 再灌2 4 h正常組 1 0 5.3 2±2.1 1 6.2 5±1.1 1 6.3 1±1.2 1缺血組 1 0 1 0.4 5±3.1 0 5 0.1 2±4.2 2 1） 5 1.2 7±4.6 5 1）實驗組 1 0 8.1 1±1.7 5 2） 2 2.2 1±2.1 5 2） 3 8.1 7±2.2 2 2）

缺血性腦血管病（腦梗死），是供應腦部的血液發生阻斷，從而引起腦組織包括神經細胞、膠質細胞等由于缺乏血液供應而發生的壞死。在腦梗死發生時，缺血腦組織如果能及時、充分地獲得側支循環，使得局部腦組織代謝需要營養物質得到恢復，就可以挽救腦組織，尤其是挽救那些瀕于壞死的神經細胞。但在血液循環恢復的同時，缺血組織重新得到供血時，也會同時出現再灌注損傷，同樣再灌注損傷也可以引起細胞的死亡和凋亡。這在目前腦梗死的治療中是一個棘手的問題。

缺血再灌注損傷是近年來腦梗死后神經保護研究的熱點，如何阻斷缺血后細胞損傷的“瀑布效應”，就能減輕神經功能缺損，減少梗死面積。故治療缺血半暗帶內處于凋亡的細胞，阻斷其進一步損傷，就能減輕梗死面積。改善腦梗死患者預后，減輕患者殘障，改善患者生活質量。

近年來細胞凋亡是醫學界研究較多的熱點問題，細胞凋亡是指機體為維持內環境穩定，由基因控制的細胞自主而有序的死亡。細胞凋亡與細胞壞死有著本質區別，在細胞凋亡過程中細胞不是被動參與的，而是主動進行的，這其中關系眾多相關基因的激活、表達以及主動調控等作用。細胞凋亡是一系列基因嚴格調控的過程，如Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因如 C-myc、抑癌基因 P53 等［2］。在腦梗死后神經元損傷過程中，細胞凋亡是否起著重要作用，目前研究可知，腦缺血后神經細胞壞死與凋亡同時存在，同時引起神經功能缺損，且同樣發揮著重要作用。

缺血性腦血管病時，缺血及缺血再灌注引起能量衰竭，細胞壞死，細胞缺血及由缺血后再灌注帶來的細胞損傷均易誘發細胞凋亡。目前，體外細胞培養與大體動物實驗均證實，凋亡這種損傷方式是神經元細胞缺血以及再灌注后的重要損傷方式。細胞凋亡的嚴重程度與細胞缺血時間、缺血后再灌注時間及程度等有一定的相關作用，也與神經系統損傷相關，故減少神經細胞凋亡數量，可達到減小梗死面積、減輕神經系統損傷的目的。

在動物模型中，我們培養出原代神經元細胞，并造出類似于腦缺血再灌注損傷模型，在這種模型基礎上我們應用丁苯酞注射液預處理缺血的神經元細胞，來模擬腦梗死后神經元再灌注損傷的生理病理過程。本實驗丁苯酞直接作用于原代培養神經元細胞，排除了藥物在改善微循環方面帶來的影響，單純研究藥物對神經元損傷的影響，可更直接地反應藥物減輕凋亡的作用。

丁基苯酞（NBP）又名芹菜甲素，是從芹菜種籽中分離出的有效成分，經合成的消旋化合物為黃色油狀液體，具芹菜香味。研究發現，NBP具有增加缺血區腦血流量和重構缺血區微循環、保護線粒體功能、改善全腦缺血后的能量代謝、減輕神經功能損傷的程度等功能，對缺血性卒中具有較強的治療作用［3-4］。

本實驗應用原代培養神經元細胞，然后制造缺血再灌注損傷模型，在此模型基礎上檢測細胞存活率、凋亡細胞等方法，證實丁苯酞注射液可顯著增加類缺血再灌注神經元細胞再灌注后細胞的存活率，這種神經保護機制在一定程度上是通過其減少神經細胞凋亡而實現的。目前推測這種作用可能通過改善微循環，改善能量代謝，保護細胞內線粒體等實現。本實驗更加證實了這種保護機制也是通過減輕細胞凋亡發揮作用的。這種作用是直接作用于細胞本身，而不需要循環支持，故不需要血液中成分參與。故丁苯酞注射液可減輕再灌注損傷，這種作用是通過抗凋亡實現的。

在今后的實驗中，我們還將進一步探討丁苯酞注射液這種抗凋亡的可能作用機制

［1］楊琨，劉瑞珍.GM-1對原代培養神經元類缺血再灌注損傷的影響［J］.中西醫結合心腦血管病雜，2009，7（10）：1 184-1 186.

［2］陳津，張如松.細胞凋亡機制概述［J］.中華中醫藥學刊，2011，29（4）：886-889

［3］Xu H L，Feng Y P.Effects of 3-n-buty lphthalide on pial arterioles in focal cerebral ischemia rats［J］.Acta Pharm Sin，1999，34（3）：172-175.

［4］張鏞，劉振芳，付慶喜，等.腦缺血和 NBP預處理對腦缺血沙鼠NGB和mit-Na-K～-ATP酶活性的影響［J］.山東醫藥，2007，47（1）：1-3.