熒光測定法體外快速篩選抗腫瘤活性物質的研究

葉松華，王曉燕，董曉麗，馮夏珍，楊瑩瑩

（山西省醫藥與生命科學研究院，山西太原030006）

惡性腫瘤是常見且嚴重威脅人類生命主要疾病之一，尋找有效的抗腫瘤藥物與方法，是世界醫學界重要的研究課題。天然產物具有結構獨特、生物活性廣泛、不易耐藥等優點，是發掘新穎抗腫瘤活性成分的重要源泉，也是有機合成和組合化學的補充。從天然植物中尋找活性成分，大規模快速篩選先導化合物，是發現新型天然抗腫瘤藥物先進、快速、有效的篩選途徑［1-2］。建立合理的抗腫瘤藥物篩選的方法和高效、簡便的篩選模型對抗腫瘤藥物的研究具有重要的意義。

快速熒光素測定法是一種近幾年發展起來的體外藥物敏感性測定方法［3］，該技術因其具有簡便、靈敏、穩定等特點得到了廣泛應用，并已成為高通量篩選的關鍵技術之一。其原理是通過細胞酶的作用使無熒光性的材料分解或轉換為熒光材料，通過測定熒光強度從而測定出活細胞的量。二乙酸熒光素（FDA）是一個非極性酯類化合物，能通過完整的細胞膜，在活細胞內被酯酶水解而產生極性的綠色熒光物質，該熒光物質不能通過完整的細胞膜，能在活細胞內保留，因此可用于活細胞標記并測定細胞活力［4-5］。

本研究建立了一種基于FDA標記活細胞的抗腫瘤活性物質快速篩選方法，并應用該方法對兩種藥用植物的抗腫瘤活性組分進行了初篩，為天然產物抗腫瘤活性物質研究提供了新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MEM培養基購自Gibco公司、胎牛血清（FBS）購自BI公司；熒光染料二乙酸熒光素（FDA）購自Sigma公司；青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶購自北京全式金生物技術有限公司；阿霉素對照品、牛胰島素、非必需氨基酸、丙酮酸鈉購自北京索萊寶科技有限公司。96孔細胞培養板，細胞培養瓶購自Coming公司。沙煲暗羅莖、海南染木樹葉采自海南昌江縣霸王嶺自然保護區。乳腺癌細胞系MCF-7購自中國典型培養物保藏中心。

1.2 實驗儀器

熒光倒置顯微鏡（德國ZEISS）；多功能微孔讀板機 SyergyH1（美國伯騰）；CO2培養箱（美國Thermo）；HH數顯三用恒溫水箱（江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠）；超凈臺（蘇州凈化SW-CJ-2D）；低速離心機SC-3610（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；藥物抑制濃度計算軟件（GraphPad Prism 5.0，美國）。

1.3 熒光測定法的建立及考察

1.3.1 FDA濃度的選擇 取對數生長期的MCF-7細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，以3 000個/孔接種于96孔板中間60孔，常規培養24 h后，棄去每孔中培養液，用PBS漂洗2次，加入100 μL/孔含系列濃度梯度 FDA（40 μg/mL，20 μg/mL，10μg/mL，5 μg/mL，2.5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.313 μg/mL，0.156 μg/mL，0.078 μg/mL） 的 PBS溶液，每個濃度3個復孔，37℃培養孵育45 min后，立即置于多功能微孔讀板機上，在激發波長為490 nm，發散波長為526 nm的條件下檢測每孔的熒光強度，并繪制探針濃度和熒光強度的關系圖。

1.3.2 方法的線性范圍考察 取處于對數生長期的MCF-7細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，從1.5萬個/孔按照倍半稀釋的方式稀釋為10個濃度，接種于96孔板的中間60孔，每個密度設3個復孔。常規培養24 h后，棄去每孔中培養液，用100 μL PBS 漂洗 2次，用含 FDA（2.5 μg/mL）的 PBS標記細胞，每孔 100 μL，37 ℃，孵育 45 min，立即置于多功能微孔讀板機上檢測每孔的熒光強度。以每孔的細胞個數為橫坐標，熒光強度為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.3.3 方法的精密度考察 取處于對數生長期的MCF-7細胞，以0.25%胰蛋白酶消化后，以3 000個/孔接種于96孔板的中間60孔，常規培養24 h后，棄去每孔中培養液，按1.3.2項操作檢測每孔的熒光強度，計算各孔熒光強度間的RSD，以考察該種方法的精密度。

1.3.4 方法的準確性驗證 按常規方法接種腫瘤細胞，3 000個/孔。培養24 h后，加藥組每孔加入100 μL含不同濃度阿霉素的培養液，阿霉素的終濃度分別為：40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL，每個濃度設 3個復孔。陰性對照組加入相同體積培養液。培養48 h后，棄去每孔中培養液，按1.3.2項操作檢測每孔的熒光強度，并按照下面的公式計算不同濃度阿霉素對腫瘤細胞的抑制率：抑制率（%）=（1-加藥組熒光強度值／對照組熒光強度值）×100%。

1.4 藥用植物化學組分的制備

將自然風干的沙煲暗羅莖進行粉碎，然后用95%乙醇浸提3次，每次7 d，將收集到的浸提液合并、減壓蒸餾，最后得到乙醇總浸膏。然后將乙醇總浸膏分散于一定量的蒸餾水中，分別用石油醚和乙酸乙酯萃取3次，將所得的萃取液合并、減壓濃縮，得到各部位浸膏，分別標記為1-1、1-2。

將海南染木樹葉粉末，用85%的乙醇溶液浸泡提取 3 次，分別為 3 d，5 d，7 d，合并濃縮，得粘稠狀浸膏；將浸膏分散在一定量的蒸餾水中，分別用石油醚、乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮得各極性部位浸膏，分別標記為2-1、2-2。

1.5 藥用植物抗腫瘤活性部位的篩查

按常規方法接種腫瘤細胞，3 000個／孔。培養24 h后，加藥組每孔加入100 μL含不同濃度提取物的培養液，使終濃度分別為：400 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、20 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL，每個濃度設3個復孔。并分別以2.5μg/mL的鹽酸阿霉素和含0.1%DMSO的培養液作為陽性對照和陰性對照。培養48 h后，棄去每孔中培養液，按1.3.2項操作檢測每孔的熒光強度，計算不同組分對腫瘤細胞的抑制率。

2 結果

2.1 基于熒光信號的抗腫瘤活性物質篩選方法的建立及考察

2.1.1 FDA濃度對熒光強度的影響 本研究考察了10個不同熒光染料濃度下的細胞熒光信號強度。當FDA濃度達到≥20 μg/mL時出現平臺期（圖1中A）；而探針質量濃度在0～5 μg/mL時，細胞的熒光強度隨著FDA濃度增加而增強（R2=0.987 8）（圖1中B）。當探針質量濃度為2.5 μg/mL時，已能滿足軟件統計的要求，而濃度過大會產生較強的背景干擾，同時染料濃度過高可能會對細胞活力產生影響，故本文FDA染料濃度定為2.5 μg/mL。

2.1.2 方法學研究結果 實驗結果表明（如圖2），每孔接種細胞在68～1.5×104個/孔的范圍內，熒光強度與每孔接種細胞數之間的線性關系良好，計算回歸方程得，y=1.892 4x-534.16，R2=0.9967。連續掃描整個96孔板中60孔，發現其熒光強度變化值較小，其RSD為10.9%，表明該方法具有良好的板內精密度。

圖1 FDA濃度對熒光強度的影響

圖2 細胞密度與熒光強度的線性關系

2.1.3 方法的準確性驗證 選擇鹽酸阿霉素作為陽性藥對建立的方法進行驗證，以考察本方法的可靠性，實驗結果如圖3所示。計算所得鹽酸阿霉素抑制MCF-7細胞增殖的IC50值為3.04 μg/mL，與歐金來等［6］使用MTT法所檢測到的結果2.7 μg/mL較為一致，說明本方法用于抗腫瘤活性物質篩選是準確可靠的。

圖3 鹽酸阿霉素對MCF-7細胞的抑制率與劑量的關系曲線

2.2 藥用植物抗腫瘤活性部位的篩查

分別對沙煲暗羅莖和海南染木樹葉的乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物（1-1，2-1）和石油醚萃取物（1-2，2-2），結果見表1。結果表明沙煲暗羅莖乙酸乙酯部位和石油醚部位、海南染木樹葉石油醚部位對MCF-7細胞均有抑制作用且呈現劑量依賴性，經計算以上三個部位的IC50值分別為134.1 μg/mL、78.46 μg/mL 和 86.87 μg/mL。而海南染木樹葉乙酸乙酯部位對MCF-7增殖的抑制作用不明顯，只在最高濃度有較弱的抑制作用。

表1 各組分對MCF-7細胞的抑制率 （%）

根據表1中的數據，沙煲暗羅莖石油醚部位在濃度400 μg/mL時的抑制率為68.51%，反而低于200 μg/mL時的抑制率，這是由于該部位由高濃度的DMSO溶液向培養基溶液稀釋的過程中，出現了較多的析出，使得培養基中的實際藥物濃度不準確。因此，在計算IC50時，為保證結果的可靠性，只使用了6.25～200 μg/mL的數據。

3 討論

本研究經過篩選合適的FDA濃度，建立了一種基于FDA熒光信號的抗腫瘤活性物質體外快速篩選方法，并用鹽酸阿霉素做為陽性藥對該方法進行了可靠性驗證。經過線性范圍和精密度的研究，對該方法進行了方法學考察，結果表明，本方法在68～1.5×104個/孔的范圍內具有良好的線性關系。李寧等［7］對CCK-8法和MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的最佳條件進行了比較，發現CCK-8法和MTT法檢測PC細胞活細胞數時，線性范圍分別是 8×102～5×104和 6.3×102～5×104。因此，本方法與傳統的體外抗腫瘤活性物質篩選的方法相比，具有更高的靈敏性和更寬的線性范圍。

應用熒光檢測法對沙煲暗羅莖和海南染木樹葉進行了抗腫瘤活性篩選，結果表明沙煲暗羅莖乙酸乙酯部位和石油醚部位、海南染木樹葉石油醚部位對MCF-7細胞均有抑制作用且呈現劑量依賴性，為這兩種藥用植物抗腫瘤活性物質的進一步篩選和以及抗腫瘤單體分離奠定了基礎。

本研究建立的熒光檢測法具有快速、靈敏、細胞線性范圍寬等特點，可用于天然產物抗腫瘤活性物質的體外快速高通量篩選，為天然產物藥效物質基礎研究提供了新的研究手段。

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［6］歐金來，洪寶賢，葉小翠，等.阿霉素果膠納米粒的制備及其體外抗腫瘤活性［J］.暨南大學學報（自然科學與醫學版），2014，35（3）：330-336.

［7］李寧，萬文婷，金林紅.CCK-8法和MTT法檢測人前列腺癌PC3細胞活性的最佳條件比較研究［J］.貴州大學學報（自然版），2009，26（3）：18-20.