PRRX1的表達對卵巢癌血管生成擬態形成及患者預后的影響

范 丹 ，宋文靜 ，2，張艷輝 ，戚 紅 ，古 強 ，2，董學易 ，2，劉 芳 ，2，趙秀蘭 ，2，孫保存 ，2，

（1．天津醫科大學病理學教研室，天津300070；2．天津醫科大學總醫院病理科，天津300052；3．天津醫科大學腫瘤醫院病理科，天津300060）

卵巢癌是女性生殖器官三大惡性腫瘤之一，其發病率居宮頸癌和宮體癌之后，其死亡率居首位，是女性最主要的惡性腫瘤之一。卵巢癌起病隱匿、進展快，缺乏有效的早期診斷手段，約70%的患者一經發現即已為晚期，治療及預后極其差[1]。因此，對卵巢癌發生機制和疾病進展的研究一直是婦科惡性腫瘤研究中的難點與熱點問題[2]。血管生成擬態（VM）是由腫瘤細胞自身變形模仿內皮細胞組成的微循環管道，內壁無內皮細胞襯覆，與宿主血管連接使腫瘤細胞獲得血液供應，對患者的生存預后有很大影響。最近，配對相關同源框1（paired related homoeobox 1，PRRX1）蛋白已被證實為一個新的上皮間質轉化（EMT）的誘導因子，其在乳腺癌、肺癌中表達可抑制腫瘤轉移，提示良好預后；而在胃癌、結直腸癌中的表達與轉移和預后差相關[3-6]，但目前對該因子在卵巢癌中表達及其具體的臨床意義的研究少有報道。本研究旨在初步探討PRRX1在卵巢癌中表達情況及其與VM的關系，以及PRRX1通過何種途徑影響VM形成，從而闡明PRRX1對卵巢癌轉移及預后的影響。

1 資料與方法

1．1 病例情況 62例卵巢癌標本來自于天津醫科大學附屬腫瘤醫院1991年1月-1999年12月期間收治的卵巢癌患者。年齡21～80歲，其中＜50歲者22例，≥50歲者40例。這些病例均進行了病理學診斷：漿液性42例，黏液性9例，子宮內膜樣癌11例；高分化24例，中分化12例，低分化26例；FIGO分期Ⅰ期20例，Ⅱ期9例，Ⅲ期33例；39例出現轉移或復發，23例未出現轉移和復發；43例患者出現腹水，19例患者未出現腹水；VM陽性組21例，VM陰性組41例。

1．2 實驗方法

1．2．1 免疫組化 免疫組化采用SP法染色。所有標本均為石蠟包埋組織，5μm厚切片，經二甲苯脫蠟，無水乙醇脫水，3%H2O2封閉內源性過氧化酶30min，梯度乙醇水化，微波熱修復10 min，自然冷卻后自來水沖洗和PBS平衡后，山羊血清于室溫封閉30min，一抗孵育4℃過夜。次日室溫恢復1 h后PBS洗3次，加二抗孵育1 h,PBS洗3次，DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染核，脫水封片。PRRX1(1∶100)為兔抗人多克隆抗體來自 Novus Biologicals公司；Wnt5a(1∶100)為兔抗人抗體來自 R&D Biosystems公司；β-catenin（1:150）為小鼠抗人單克隆抗體來自北京中杉金橋公司；CD31（1∶50）為兔抗人單克隆抗體來自北京中杉金橋公司。

1．2．2 CD31與PAS雙重染色 免疫組化常規染完CD31后，滴加過碘酸鈉孵育15min于室溫中，自來水沖洗5min后蒸餾水洗5次，然后滴加雪夫試劑，置于37℃孵箱避光20min，自來水沖洗20 min后蒸餾水洗5遍，蘇木精復染核、自來水洗5min，脫水后封片。1．3 結果判斷 結果判定根據細胞漿或細胞核出現的棕黃色顆粒樣染色的細胞數和染色強度判定陽性表達情況。具體計數方法參考Sood等的評分方法：每例標本選擇10個含有陽性細胞的高倍視野（×400）分別計數100個腫瘤細胞，取其平均值計算陽性細胞百分率。0分：陽性細胞＜5%；1分：陽性細胞5%～25%；2分：陽性細胞25%～50%；3分：陽性細胞＞50%。染色強度：1分：淺黃色；2分：深黃色；3分：棕黃色。總計分=陽性細胞百分率計分+染色強度計分，總計分≤2分為陰性，＞2分為陽性。

1．4 統計學分析 采用SPSS17．0軟件進行統計學分析。計數資料組間率的差異比較采用χ2檢驗、Pearson相關分析，使用Kaplan-Meier法進行生存分析。組間差異比較以P＜0．05為顯著性檢驗水準。

2 結果

2．1 PRRX1蛋白的表達與卵巢癌患者臨床病理指標的相關性 在卵巢癌中PRRX1表達于癌細胞胞核，62例卵巢癌組織中PRRX1的陽性病例數為33例，有VM形成的為21例（圖1）。PRRX1表達與卵巢癌患者的FIGO分期、轉移及VM的形成密切相關且具有統計學意義（P＜0．05），與患者的年齡、腫瘤大小、組織學類型和分級無明顯統計學差異（P＞0．05）（表1）。

圖1 卵巢癌組織PRRX1的表達和CD31/PAS的雙染（×200）Fig 1 PRRX1 expression and CD31/PAS double staining in ovarian cancer（×200）

表1 PRRX1蛋白的表達與卵巢癌患者臨床病理特征的關系Tab 1 RelationshipbetweenPRRX1 expression and the clinicopathology of patients with ovariancancer

2.2 PRRX1表達與卵巢癌預后的關系 62例卵巢癌患者根據PRRX1的表達情況分為陽性表達組和陰性表達組，Kaplan-Meier生存分析顯示PRRX1陰性表達的卵巢癌患者生存時間明顯長于PRRX1陽性表達卵巢癌患者，具有統計學意義（P=0.038）。PRRX1陽性表達和存在VM的患者生存時間比PRRX1陰性表達或無VM形成的患者短（P=0.002）且預后差（圖2）。

2.3 Wnt5a、β-catenin在卵巢癌中的表達及其與PRRX1的關系 Wnt5a主要表達于癌細胞胞漿；β-catenin主要表達于癌細胞胞膜或胞漿，部分胞核陽性。在62例卵巢癌組織中Wnt5a、β-catenin漿、β-catenin核的陽性病例數分別為16例、39例、25例 (圖 3)。χ2和 Pearson相關分析結果顯示PRRX1表達與β-catenin核陽性表達密切相關（rs=0.309,P=0.014），PRRX1 表達與 Wnt5a、β-catenin漿陽性表達不相關（rs=0.110,P=0.396；rs=0.217，P=0.090）（表2、3）。

圖2 卵巢癌中PRRX1表達和VM形成中的生存曲線圖Fig 2 The survival curve of PRRX1 expression and VM formation in ovarian cancer

圖3 卵巢癌組織Wnt5a和β-catenin的表達（×200）Fig 3 Wnt5a and β-catenin expressions in ovarian cancer（×200）

表2 卵巢癌中PRRX1與Wnt5a、β-catenin漿、β-catenin核表達的相關性Tab 2 CorrelationsbetweenPRRX1andWnt5a,β-cateninof patientswithovariancancer

表3 卵巢癌中PRRX1與Wnt5a、β-catenin漿、β-catenin核表達的Pearson相關性Tab 3 PearsoncorrelationbetweenPRRX1andWnt5a,β-catenin ofpatientswithovariancancer

2．4 PRRX1 表達和 Wnt5a、β-catenin 漿、β-catenin核表達與卵巢癌患者生存預后的關系 62例卵巢癌患者PRRX1陽性表達和β-catenin核陽性表達的患者生存時間短于PRRX1陰性表達或β-catenin核陰性表達的患者(P=0．023)；而PRRX1陽性表達與Wnt5a陽性表達、β-catenin的漿陽性表達的患者生存時間與PRRX1陰性表達或Wnt5a陰性表達、β-catenin的漿陰性表達的患者生存時間相比，差別無意義（P=0．840；P=0．137）。

3 討論

卵巢癌患者的主要死因是腫瘤的轉移和復發，而腫瘤的生長和轉移都具有血管依賴性，因此腫瘤血管生成和VM的形成對患者的生存預后起重要作用[7]。VM是由腫瘤細胞自身變形模仿內皮細胞組成的微循環管道，內壁無內皮細胞襯覆。其形成有3個關鍵環節：腫瘤細胞的自身變形，腫瘤細胞及細胞外基質的重塑和其與宿主血管連接使腫瘤細胞獲得血液供應[8]。研究表明，腫瘤細胞的“可塑性”是VM形成的關鍵[9]。EMT是指在特定的生理和病理條件下上皮來源細胞向間質源性細胞轉化的一種現象，與腫瘤的侵襲轉移密切相關[10]。而形成VM的腫瘤細胞失去上皮細胞特性而獲得內皮細胞的功能和表型，這一過程和EMT有關。已有研究表明EMT的轉錄調節蛋白Twist、ZEB-1的表達對腫瘤組織VM形成具有調節作用[11-12]，因此推測有些誘導EMT的轉錄調控因子可能促進VM形成。在本組實驗中，PRRX1作為一個新的EMT的誘導因子，與VM的形成密切相關且具有統計學意義（P＜0．05），在PRRX1陽性表達和存在VM的患者中，其生存時間短且預后差。

PRRX1是同源框轉錄因子paired-type家族中的一員，可調節間充質前體細胞的分化[13]，已被證實為一個新的EMT的誘導因子，是一種DNA相關蛋白，其功能是轉錄共激活，通過增加血清反應因子的DNA結合活性進行轉錄活化。PRRX1作為一個新發現的EMT誘導物與經典的EMT誘導物[14]不同，關鍵區別在于干細胞樣特性誘導：PRRX1誘導EMT的發生并不伴隨干性的獲得[15]。PRRX1的缺失可使乳腺癌細胞發生MET（mesenchymal–epithelial transition）并獲得干性樣表型[15]；相反，結直腸癌中PRRX1表達促進EMT發生和干性樣特性的獲取[6]。對PRRX1功能的研究顯示該基因作為一種轉錄因子可調控多種基因的表達[16]，PRRX1參與軟骨細胞的分化過程[17]，其在肢芽形成和骨骼發育中起重要作用[18]，由腫瘤壞死因子（TNF）激活的PRRX1可抑制類風濕性關節炎、更年期人群和老年人中的骨形成[19]。在老鼠胚胎的心臟和骨骼肌中PRRX1高度表達，PRRX1的缺失會使老鼠在圍產期時死于顱面和肢體畸形[20]。在正常成人的大腦中PRRX1在神經細胞譜系轉換和維持成人神經干細胞自我更新中起到關鍵作用[21]，PRRX1通過調控內皮細胞分化而參與肌腱蛋白-C表達和肺血管形成過程[22]。另外PRRX1促進胰腺再生并致癌[23]。但該蛋白在腫瘤發生和發展中的作用尚不完全清楚。有研究表明，在惡性膠質瘤中PRRX1的缺失可抑制惡性膠質瘤細胞侵襲和神經球形成，而其表達誘導激活Notch信號參與惡性膠質瘤細胞的浸潤[24]。但也有研究顯示該基因的缺失可引起體內癌細胞的轉移[15]。這可能是因為在不同系統的腫瘤之間PRRX1的表達和功能存在差異。在胃癌[5]中，PRRX1過表達導致EMT分子標記物N-cadherin、E-cadherin和vimentin以及核內β-catenin、Wnt/β-catenin 靶基因 c-Myc 的水平的變化，而且Wnt/β-catenin信號的抑制劑XAV939抵消了PRRX1過表達的作用。說明PRRX1是通過激活Wnt/β-catenin信號誘導EMT的發生。在本組實驗中，發現PRRX1的表達與β-catenin核陽性表達有關，初步推斷在卵巢癌中PRRX1可使βcatenin入核從而激活Wnt通路。

Wnt（Wingless）基因是在小鼠乳腺癌中首先發現的，在多種組織中廣泛表達且具有高度的保守性，在胚胎發育過程中調節細胞的增殖、分化、遷移、極性和凋亡，與人類某些常見的惡性腫瘤的發生、發展關系密切[25]。Wnt蛋白大致分為兩類：一類是Wnt1類，激活Wnt經典通路，即Wnt/β-catenin信號通路；另一類為Wnt5a類，可觸發Wnt非經典通路（不依賴β-catenin的Wnt通路），包括Wnt/Ca2+和Wnt/PCP信號通路等[26-27]。Wnt5a基因是一種分泌性糖蛋白，是Wnt非經典家族中的重要成員，目前對其作用機制的研究存在較大分歧：Wnt5a既能活化經典的Wnt/β-catenin通路又能活化非經典Wnt/Ca2+通路，并且二者之間相互作用，導致Wnt5a在不同腫瘤中的生物學作用不一致，在甲狀腺癌[28]中起抑癌作用而在胃癌[29]中起到促癌的作用。βcatenin蛋白作為Wnt經典通路的重要成員，其蛋白穩定性和活性的調節是Wnt通路中的關鍵事件之一。通路傳導模式是：細胞外的Wnt蛋白與細胞膜上的受體Frizzled/LRP結合啟動Wnt信號，然后通過磷酸化并激活細胞漿內的Dsh蛋白，抑制GSK3IS／APC／Axin 復合物對 β-catenin 的磷酸化。胞漿內未被磷酸化的β-catenin蛋白可以逃逸被泛素水解系統降解的命運，繼而進入細胞核內，與轉錄因子LEF/TCF共同作用，激活靶基因的轉錄。因此，β-catenin蛋白在細胞內的異常累積不僅是Wnt通路激活的標志事件，還是多種腫瘤中的常見事件之一[30-31]。在生理或者病理條件下，Wnt/β-catenin經典的信號通路還參與EMT的形成和調控[32]。當Wnt/β-catenin通路活化使β-catenin向細胞核內聚集破壞了 E-cadherin/α-catenin/β-catenin 復合體的穩定性，E-cadherin作用減弱，促進EMT發生[33-34]。Wnt/β-catenin是參與調控EMT的重要信號通路，而EMT在VM的形成過程中具有重要作用，因此，我們推測Wnt/β-catenin信號通路活化促進EMT發生進而影響VM形成。在結腸癌[35]中證實了Wnt/β-catenin信號通路活化促進腫瘤細胞EMT發生并在VM形成過程中發揮重要作用，而Wnt/β-catenin信號通路抑制劑Dkk1可逆轉結腸癌細胞EMT，抑制結腸癌細胞向內皮細胞轉化，抑制VM形成。在肝癌[36]中，XAV939 可通過抑制 Wnt/β-catenin 信號通路，降低其下游血管擬態相關因子ZEB-1和MMP-7的表達，從而抑制人肝癌細胞血管生成擬態的形成。亦說明了Wnt/β-catenin信號通路對VM的形成起促進作用。

綜上，PRRX1作為一個新的EMT的誘導因子，可通過激活Wnt/β-catenin信號誘導EMT的發生，而Wnt/β-catenin信號通路活化促進EMT發生進而影響VM形成。在卵巢癌組織中，PRRX1表達與卵巢癌患者VM的形成、生存預后密切相關，且與βcatenin核表達相關，因此初步推測PRRX1可能是通過經典的Wnt/β-catenin信號通路調節VM形成從而影響卵巢癌患者預后，為卵巢癌中VM形成和轉移的機制研究提供新思路。本實驗只是推測PRRX1可能是通過經典Wnt通路對VM進行調控，因此還需要進行大量的體外實驗來驗證并探討具體的機制。

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