17α-甲基睪丸酮誘導白斑狗魚性逆轉初步研究

李 飛，胡 瓊，張俊杰

(新疆農業大學動物科學學院，烏魯木齊 830052)

白斑狗魚(Esoxlucius)是國內外重要的亞冷水性經濟魚類之一，其生長速度快，肉質堅韌，肉味鮮美，營養價值高，沒有肌間刺，可食部分大，因此深受人們喜愛；且白斑狗魚的市場價格居高不下，養殖潛力相當巨大[1]。研究表明，白斑狗魚雌魚生長明顯快于雄魚，而且性成熟更晚，壽命更長[2]。如果能實現白斑狗魚全雌單性生產，將對提高白斑狗魚養殖效益有著重要的意義。但是未見用17α-甲基睪丸酮誘導白斑狗魚性逆轉的研究報道。

魚類性別的人工控制方法有很多種，比較常用的幾種方式有雜交育種，性激素處理、雌核發育、多倍體育種等。當然，關于魚類的單性生產及養殖很多學者做了這方面的研究，并且取得了一定的成果。河鱸(Percafluviatilis)[3]、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[4]、黃鱔(Monopterusalbus)[5]和鯽(Crucianauratus)[6]等魚類用投喂法，溫度調控誘導法或外源雄激素埋植法數月后,都獲得了功能性雄魚，即偽雄魚(其自身遺傳物質仍為雌魚的)。到目前為止,在魚類的激素誘導性轉化實驗中至少在15個科47種的雌雄異體和9個科34種的雌雄同體魚類中取得成果,所使用的激素多達31種，在雄性化誘導中以人工合成的17α-甲基睪酮(17α-MT)誘導轉雄效果最好[7]。用性類固醇激素誘導魚類性轉化的研究內容分為以下幾個部分：篩選激素、應用的處理方法、處理時間以及處理強度等[8]。

實驗用的17α-MT對白斑狗魚雄性化誘導研究主要目的在于了解白斑狗魚性腺分化的時間節點和17α-MT對其誘導效果以及是否有嚴重的致死效應，為今后獲得白斑狗魚偽雄魚進行全雌魚苗生產(偽雄魚與正常雌魚交配)奠定理論基礎；同時為魚類繁殖生物學研究以及白斑狗魚性腺發育規律研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗所用白斑狗魚為2016年4月12日在室內經人工干法授精，在孵化槽內進行循環流水孵化并于2016年4月20日孵出的仔魚。這些仔魚用室內循環流水式系統在水箱(規格為60 cm×40 cm×30 cm)中養殖，水體日交換過濾次數為5次，并用增氧機全天24 h增氧。試驗初期水溫在11～12 ℃，出膜后逐漸提高到12～14 ℃，最終提高至18 ℃左右飼養。孵出后4 d左右開始投喂人工孵化的鹵蟲，第10天開始投喂切碎的水蚯蚓，并根據仔魚的生長情況，逐漸過渡到不再切碎，一直投喂至試驗結束為止，試驗魚每天投喂兩次以保證餌料充足。

1.2 試驗藥品及餌料的配制

試驗所用17α-甲基睪丸酮購自上海源葉生物科技有限公司。17α-MT為白色粉末狀藥品，經精密稱定完全溶解于無水乙醇中配制成1 mg/mL 的原液儲存于4 ℃冰箱中，待使用時只需用水稀釋50倍即可，即達到試驗所需的濃度20 mg/L；試驗所需濃度是根據Yamamoto等[9]建立的有效激素處理標準設置的。試驗組所需投喂的水蚯蚓在20 mg/L 的17α-MT中浸泡1 h即可。

1.3 試驗設計及樣品的處理

試驗開始前先將人工孵化的白斑狗魚隨機選出900尾無傷無病的仔魚，平均分成6個大組每組150尾魚；每個大組再設置3個平行，每組50尾魚；其中4個大組為試驗組，分別在出膜后的第10、20、30、40天投喂經20 mg/L 17α-MT浸泡的水蚯蚓，投喂以0.5 h吃完為佳，若未吃完則將剩余餌料及時吸出，各組投喂的持續時間均為30 d，然后轉為投喂正常的水蚯蚓；第5組為乙醇對照組(簡稱乙醇組)，在出膜40 d后對其投喂與試驗組等量的經20 mg/L無水乙醇浸泡的水蚯蚓，連續投喂30 d后轉為投喂正常餌料；第六組為空白對照組(簡稱空白組)，始終投喂正常餌料。

所有試驗魚在2016年11月10日和12日將存活的仔魚分兩批進行解剖并取出性腺，在Bouin’s固定液中固定24 h后用加入少量氨水(去除固定液顏色)的70%乙醇沖洗再轉入70%乙醇中保存。

在試驗魚飼喂的過程中觀察并記錄各組仔魚的反應，尤其是死亡情況及原因。

1.4 組織學分析

采集的樣品經乙醇梯度脫水，二甲苯透明，滲蠟，包埋，然后進行連續橫切，厚度為5～7 μm，HE染色，最后用Motic光學顯微鏡觀察分析并拍照取圖。根據性腺的組織結構判斷其性別，記錄其性別情況。

1.5 數據分析

將飼喂期間記錄的各組死亡數、性腺觀察結果的性別情況錄入Excel表格；計算各組雄性率及平均存活率和標準差，試驗數據都用平均值±標準差(mean±S.D)的形式表示。然后用Spss19.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，用LSD多重比較法檢驗各組間仔魚存活率是否有顯著性差異，顯著性水平設置為0.05。

2 結果與分析

2.1 不同處理組對白斑狗魚存活率的影響

飼喂白斑狗魚仔魚時各組魚進食情況良好，投喂餌料時仔魚均競相吞食。但在整個飼喂過程中各組魚均發生了不同程度的死亡。其中投喂17α-MT的4個實驗組的仔魚的反應基本一致，均表現為一種較空白組稍興奮的狀態，在箱內頻繁快速地游動；在激素投喂期內箱內的少部分仔魚又轉變為較空白組安靜地狀態，食欲不振，甚至停止進食，最后安靜的停留在箱底，基本在一周內死亡；激素投喂期結束后繼續投喂正常餌料，但在飼養過程中試驗組均出現了不同程度的畸形魚，有的是脊索彎曲，有的是背鰭部位骨質增生，這些魚有的在后期生長時又恢復了正常形態，有的則在數天后死亡。乙醇組和對照組未出現上述的異常情況，但也有一定數量的死亡，主要死亡原因為仔魚間相互追咬(白斑狗魚在幼魚階段有殘食現象)。

所有仔魚在培育至2016年11月12日(7月齡)全部處死取出性腺并統計各組存活尾數，計算各組平均存活率(見表1)。統計分析結果顯示1、2、3組間存活率無顯著差異，4組，乙醇組，空白組間存活率無顯著差異。1組分別與4組和乙醇組；2、3組分別與4組，乙醇組，空白組間存活率存在顯著差異，即在出膜30 d前投喂17α-MT對其有顯著致死效應；乙醇組與空白組間存活率無顯著差異，即無水乙醇對其無顯著致死效應。

表1 不同處理對各組白斑狗魚平均存活率影響的多重比較表Tab.1 The impact of different treatments on each E.lucius average survival rate of multiple comparison %

注：*表示有顯著差異(P<0.05)

2.2 17α-MT對白斑狗魚性腺分化及性別比例的影響

將7月齡全部處死取出性腺固定并進行組織切片，顯微觀察各組魚性腺發育情況，判斷每條魚的性別。結果顯示各組魚的性腺均出現了三種分化現象：單一精巢結構，單一卵巢結構，精巢卵巢結構混長(如圖1所示)；由于對照組乙醇組和實驗組均出現了這種情況，所以這種情況的出現不是投喂17α-MT導致的，而是白斑狗魚特殊的性腺分化方式所致。根據觀察到的這三種情況進行了分組(雌性，雄性，兼性)，統計情況如表2所示。結果顯示實驗組1(10 d喂藥組)的雄性率40.8%，高于其它各組(10%，8.5%、6.3%、8.2%、26.3%)，說明試驗組在不同的時間投喂17α-MT對其雄性率的影響程度是不同的，在出膜20 d后投喂17α-MT時其性腺已經開始分化，藥物對其性別分化影響程度小，因此推斷其性腺分化的時間節點可能是在出膜后10～20 d。

圖1 各組中白斑狗魚性腺三種分化現象的組織切片Fig.1 The tissue sections for three differentiation phenomenon of E.lucius gonad in each experimental group 1.單一卵巢組織的性腺，示處于第二時相卵母細胞。2.單一精巢組織的性腺。3.精巢組織與卵巢組織共存的性腺。 (OC：卵巢腔，TA：性腺被膜，L：精小葉，LL：小葉腔)

組別各組仔魚數/尾開始喂藥時間/d喂藥持續時間/d最終取樣數/尾雄性率/%實驗組1150孵化后103049408實驗組2150孵化后203040100實驗組3150孵化后30304785實驗組4150孵化后40306463乙醇組150孵化后40306182空白組150始終投喂正常餌料始終投喂正常餌料57263

在進行性腺發育的形態學觀察時，同為7月齡的白斑狗魚但其性腺發育的程度卻存在明顯的差異，主要表現為一些性腺飽滿里面充滿了生殖細胞(卵母細胞，精原精母細胞和精子)，性腺的橫切面積較大；另一些性腺窄小，性腺內生殖細胞少，橫切面積小。性腺窄小的情況主要出現在投喂藥物的4個試驗組，而乙醇組和空白組相對較為飽滿。在整個觀察過程中未見有成熟的卵子，大多處于第二時相卵母細胞說明此時還未性成熟，并且染色加深有退化跡象；但卻觀察到大量的精原母細胞和成熟精子(如圖2所示)。

圖2 白斑狗魚卵巢和精巢發育情況的組織切片Fig.2 The tissue section for ovary and testis development situation of E.lucius1.卵巢中退化的卵母細胞。2.精巢中各期雄性生殖細胞。(SG：精原細胞，SC：精母細胞，S：精子細胞) 3.精巢中呈渦流狀分布的精子。S：精子

3 討論

3.1 投喂17α-MT對白斑狗魚存在顯著致死效應

17α-MT是人工合成的雄激素，因其價格低廉誘導效果佳被廣泛應用于魚類雄性化誘導試驗中。但有研究指出，性別決定類型為雄性配子異型(XY♂)的魚類其雌魚(XX♀)雄性化后(XX♂)的平均存活率僅為24%，同樣的雌性配子異型(ZW♀)魚類其雄魚(ZZ♂)雌性化后(ZZ♀)的存活率為20%[7]。研究表明，性別表型與遺傳型不一致的魚類生存能力明顯減弱。激素誘導魚類性轉化還存在一個耐受閾值，處理強度在此值內對存活率無顯著影響，超過這個值就會降低存活率[10]。在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[11]和斑馬魚(Daniorerio)[12]的雄性化誘導中均表現為MT處理組存活率明顯低于對照組，而在七彩神仙魚(S.aequifasciata)[13]的MT雄性化誘導中激素濃度為40、60 mg/kg其濃度明顯高于本試驗20 mg/L但對其存活率沒有顯著影響。還有學者研究發現激素誘導魚類性轉化會造成內臟的損傷[14]。

本試驗對白斑狗魚在出膜30 d前投喂17α-MT出現顯著死亡現象分析其原因：第一可能是成功誘導雄性化的仔魚在后天的養殖過程中因為生存能力較弱而死亡；第二激素誘導的強度過大，超過了白斑狗魚的耐受閾值；第三可能是激素處理對其內臟造成了不同程度的損傷，致使其生長過程中出現畸形而死亡。出膜40 d投喂組未出現顯著死亡可能是其個體較大自身的免疫力較強，具體原因有待進一步研究。因為不同魚類的最優誘導強度不同，所以關于白斑狗魚的雄性化誘導強度有待進一步研究。

3.2 各處理組對白斑狗魚性腺分化的影響

Demska-Zakes等[15]用11β-HA對白斑狗魚仔魚進行雄性化誘導濃度為20 mg/kg和30 mg/kg在105 d后復查性別出現了13%，17%的兼性(intersexuality)和74%，83%的雄性比例。隨后Luczynski等[16]做了17α-MT對雌核發育的白斑狗魚雄性化誘導試驗，濃度分別為20,30,60 mg/kg，結果出現了13%，17%，24%，76%的兼性和16%，76%，77%，87%的雄性比例，由此確定白斑狗魚是雄性配子異型(XY)的染色體性別決定類型并總結白斑狗魚雄性化誘導的最佳濃度為30 mg/kg，最佳處理魚體長度是在26～30 mm。以上研究出現兼性的原因主要有兩點：第一激素處理強度過大主要表現為激素濃度過高，第二在誘導時性腺已經開始分化。本試驗中對照組與試驗組均出現了不同程度的兼性，而以上研究對照組未出現兼性現象。分析試驗組出現兼性的原因也有兩點：第一白斑狗魚性腺的自然分化過程就存在兼性現象，第二激素處理強度過大主要表現為處理持續時間過長。

白斑狗魚在食物充足的自然水體中雄魚產生精子在1齡，雌魚卵母細胞開始積聚卵黃在2齡，體長在29～36 cm[17]。本試驗白斑狗魚在7月齡性腺處于不成熟階段，但雄魚產生了精子，說明17α-MT促進了生殖細胞的發展。劉少軍[18]在對革胡子鯰(Clariaslazera)雄性化誘導中指出MT對精巢具有雄性催熟作用。喂藥的四個試驗組中的雌性仔魚性腺的橫切面積較小，卵母細胞個體較小數量較少，其原因可能是MT在對精巢具有雄性催熟作用的同時對卵巢的發育具有一定的抑制作用，趙春剛等[19]在斑馬魚性腺發育的研究中發現外源雄性激素對雌性斑馬魚的性腺發育影響明顯，較高劑量時可導致外源激素的閹割作用。

試驗結果顯示，除試驗組1外其它各試驗組的雄性率相差不大并且與乙醇組雄性率較為接近(10%，8.5%，6.3%，8.2%)，但均表現出低于空白組雄性率(26.3%)。那么反之就是實驗2、3、4組和乙醇組的雌性率與兼性率之和要高于空白組的雌性率與兼性率之和，分析其原因有兩點：第一20 d后喂藥組對其轉雄的作用由于性腺已經開始分化而減弱，使其產生了更多的兼性和雌性；第二是無水乙醇也具有一定的雄性化作用，但由于未達到適宜的濃度和作用時間點使其轉雄的作用減弱而產生了更多的兼性和雌性。陳本德[20]在MT誘導雌核發育鯽魚雄性化研究中通過3年的重復試驗證明了1 mL/g的95%工業酒精能使雌核發育鯽魚60%～84.6%成功轉雄。但是關于酒精對性腺分化影響的研究較少，本試驗的乙醇對照具體作用原因還有待進一步研究。

3.3 白斑狗魚特殊的性腺分化方式

硬骨魚類性腺分化方式多種多樣。主要可分為三大類：雌雄同體、雌雄異體、兼性。而雌雄同體又可分為連續型雌雄同體和同步性雌性同體；雌雄異體也可分為兩種，分化型雌雄異體和未分化型雌雄異體，需要注意的是未分化型雌雄異體又表現出兩種不同的類型,雄性先熟型和雌性先熟型[21-22]。兼性是指性腺中既含有精巢組織又含有卵巢組織只是各自所占的比例不同，并且能夠產生有活性的卵子或精子[22]。兼性是雌雄異體魚類中一種少見的現象，在野生種群中兼性的概率僅為0.02，目前認為出現兼性的原因為環境因子對性腺的影響或是性腺內生殖細胞的變異[21]。

Maack等[23]對斑馬魚(Daniorerio)性腺分化組織學形態學研究表明，仔魚在5周齡時有87%的魚性腺分化處于核仁周邊期卵母細胞，而從5周齡開始一些魚性腺中卵母細胞數量減少尺寸變小嗜堿性增強，最終退化,在11周齡有40%的性腺發育為早期精巢。皇家絲鱸(Grammaloreto)[24]性腺分化方式也與此類似,并且它們的性腺分化方式都屬于未分化型雌雄異體。

本試驗中各組白斑狗魚性腺中均出現了精巢組織與卵巢組織共存的現象，并且7月齡的白斑狗魚性腺中的卵母細胞均處于第二時相卵母細胞。在試驗組與對照組中均觀察到不同程度的卵母細胞染色加深(嗜堿性增強)發生皺縮，說明卵母細胞有退化的跡象，可能在向精巢發展。這種分化現象與以上研究結果類似，由此判斷白斑狗魚性腺分化方式可能也屬于未分化型雌雄異體型。作者在進行白斑狗魚雄性化誘導試驗的同時也進行了白斑狗魚性腺自然分化規律的研究(另文發表)，結果表明在性腺分化過程中確實存在大量的類卵巢結構，在196 d時出現大量的精巢組織與卵巢組織共存的現象。

4 結論

本試驗證明用經濃度為20 mg/L 17α-MT浸泡的餌料連續投喂30 d對白斑狗魚有明顯的致死效應；在進行性腺的組織學分析時發現白斑狗魚的性腺分化存在一個兼性的分化過程，這種分化類型的特點與未分化型雌雄異體魚類相吻合。對于未分化型雌雄異體魚類性別控制由于其性別分化的特殊性，在性別分化時存在一個自身的性別轉化過程，如果要成功地控制其性別比例就要找到其雌性和雄性轉變的時間節點，在這個分化的節點對其進行激素誘導方可獲得較好的效果。白斑狗魚的性腺分化轉雄的時間節點應該在出膜后10-20 d。

[1]郭 焱.新疆魚類志[M].烏魯木齊：新疆科學技術出版社,2012：19-23.

[2]Robert M N，David W W，Steven M,et al.Seasonal growth of northern pike (EsoxIucius)in a south dakota glacial lake[J].J Freshw Ecol.1994,9 (3):191-196.

[3]Carole1 C R，Bruno1 J，Patrick K,et al.Sex control and sex determinism study in Eurasian perch,Perca fluviatilis,by use of hormonally sex-reversed male breeders[J].Aquaculture，2002,211(1):81-89.

[4]陳興漢,劉曉春,蒙子寧,等.溫度調控誘導尼羅羅非魚仔魚雄性化的研究[J].中山大學學報(自然科學版),2013,52(1):94-99.

[5]Chu Z J，Wu Y X，Gong S Y,et al.Effects of estradiol valerate on steroid hormones and sex reversal of female rice field eel,Monopterus albus (Zuiew)[J].J World Aquac Soc，2011,42(1):96-104.

[6]Luo K K，Xiao J，Liu S J,et al.Massive production of all-female diploids and triploids in the crucian carp[J].Int J Biol Sci，2011,7(4):487-495.

[7]Pandian T J，Sheela S G.Hormonal induction of sex reversal in fish[J].Aquaculture，1995,138(1):1-22.

[8]樓允東.魚類育種學[M].北京：中國農業出版社，2001.

[9]Yamamoto T,Kajishima T.Sex differentiation [M]//Hoar W,Randall D.Fish Physiology.Academic Press,1969：117-175.

[10]Blazquez M，Zanuy S，Carrillo M,et al.Structural and functional effects of early exposure to estradiol-17β and 17α-ethynylestradiol on the gonads of the gonochoristic teleost dicentrarchus labrax[J].Fish Physiol Biochem，1998,18(1):37-47.

[11]姚道霞.黃顙魚性分化及激素誘導性轉化研究[D].哈爾濱:東北林業大學,2007.

[12]范 鵬.甲基睪酮(MT)對雌性及未性分化斑馬魚(Daniorerio)的影響[D].哈爾濱:東北農業大學,2009.

[13]徐亞飛.七彩神仙魚的性腺發育及17α-甲基睪丸酮對其性腺發育影響的初步研究[D].上海:上海海洋大學,2014.

[14]Overbeeke A P V，McBride J R.Histological effects of 11-ketotestosterone,17α-methyl testosterone,estradiol,estradiol cypionate,and cortisol on the interrenal tissue,thyroid gland,and pituitary gland of gonadectomized sockeye salmon (Oncorhynchus nerka)[J].Can J Fish Aquat Sci，1971,28(4):477-484.

[15]Demska-Zakes K，Krol J，Luczynski M J,et al.Masculinization of northern pike fry using the steroid 11 β-hydroxy androstenedione[J].N Am J Aquac，2000,62(4):294-299.

[16]Luczynski M J，Demska-Zakes K，Dabrowski K,et al.Masculinization of gynogenetic northern pike juveniles using 17 α-methyltestosterone[J].N Am J Aquac，2003,65(3):255-259.

[17]Treasurer J W.The Annual reproductive-cycle of PIKE,Esox-luciusL,in 2 scottish lakes[J].J Fish Biol，1990,36(1):29-46.

[18]劉少軍.甲基睪丸酮誘導革胡子鲇雄性化試驗及性腺觀察[J].湖南師范大學自然科學學報,1991,(4):346-350.

[19]趙春剛,范 鵬,劉 奕,等.甲基睪酮對雌性斑馬魚性腺發育的抑制作用[J].東北農業大學學報,2010,41(12):70-74.

[20]陳本德.甲基睪丸酮誘導鯽魚雌核發育子代性轉化的研究[J].水產學報,1982,(2):147-152.

[21]游秀容.大黃魚原始生殖細胞發生、遷移及性腺性別分化的組織學研究[D].福建廈門:集美大學,2012.

[22]蘇 敏.黑脊倒刺鲃胚胎、幼魚的發育及原生殖細胞的起源、遷移和分化的研究[D].福州:福建師范大學,2003.

[23]Maack G，Segner H.Morphological development of the gonads in zebrafish[J].J Fish Biol，2003,62(4):895-906.

[24]Asoh K，Shapiro D Y.Bisexual juvenile gonad and gonochorism in the fairy basslet,gramma loreto[J].Copeia,1997，(1):22-31.