草魚呼腸孤病毒Ⅱ型VP6蛋白多克隆抗體制備及其特異性分析

湯亞方，曾偉偉，王 慶，王英英，石存斌，馮 茹，高 輝，王承寶

(1.西北農林科技大學動物醫學院，陜西楊凌，712100；2.農業部漁藥創制重點實驗室， 廣東省水產動物免疫重點實驗室，中國水產科學院珠江水產研究所，廣州，510380)

草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)致病力強，傳播速度快，感染該病毒而導致的草魚出血病(grass carp hemorrhage disease，GCHD)發病季節長、流行范圍廣、死亡率高，嚴重危害我國草魚養殖業的健康發展[1-3]。草魚的天然免疫在抵擋病毒等入侵方面發揮著重要作用，其體內的模式識別受體主要分為4類：Toll樣受體(TLRs)、維甲酸誘導基因(RIG)I樣受體(RLRs)、NOD樣受體(NLRs)、C型凝集素受體(CLRs)，這四種模式識別受體在體內通過不同信號傳導途徑在機體內產生級聯放大效應，刺激機體產生抗病毒免疫反應。過去幾十年里，通過對病原體的識別、致病規律、硬骨魚類抗病毒免疫網絡機制的研究等方面逐漸深入，草魚出血病的預防措施正在不斷完善和加強[4]。GCRV基因組由11個分節段的dsRNA組成，編碼7種結構性多肽(VP1-VP7)，5種非結構性多肽(NS1-NS5)[5,6]。由于病毒基因組分節段，使得不同毒株之間可以發生重配而產生高度變異的新株型，目前已知的GCRV有40多個分離株，其中部分已完成基因組測序[7]，關于GCRV基因組的分型目前尚未形成統一的標準，但普遍共識是我國流行的GCRV毒株分為至少I、Ⅱ、Ⅲ型[2,8-10]三種基因型。近幾年我國草魚出血病病原調查分析表明，當前我國的草魚出血病呈現出不同基因型病毒單獨感染和混合感染的態勢，其中Ⅱ型占96%以上，為當前的主要流行基因型[7]。

生物信息學分析表明，GCRVⅡ型毒株S9基因節段編碼一個長達418 aa的蛋白質(VP6)，分子質量約為42.86 ku[11]；GCRVⅡ型毒株S9基因編碼核苷酸序列和氨基酸序列的同源性均96%以上。Fang等[5]的研究表明，VP6蛋白參與GCRV病毒粒子內衣殼蛋白的構成，能連接內衣殼和外衣殼，因此推測GCRVⅡ型 S9基因編碼的蛋白為一種結構蛋白。本實驗選取GCRVⅡ型代表毒株GCRV-HZ08株，PCR擴增S9基因片段、構建原核表達載體誘導VP6蛋白表達，蛋白純化后免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，并采用Western blot和間接免疫熒光試驗初步分析制備的多克隆抗體的免疫學特性，意在為GCRVⅡ型病毒S9基因節段編碼蛋白的功能研究、GCRV Ⅱ型病原學特性研究以及草魚出血病的臨床診斷和防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

GCRV GZ1208、HZ08、HuNan1307株，鱖彈狀病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)，錦鯉皰疹病毒(Kio herpesvirus,KHV)，大嘴鱸魚病毒(large-mouth Bass virus,LMBV)，傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)均由珠江水產研究所魚病室分離并保存；HGDRV株由中國水產科學研究院長江水產研究所惠贈；草魚魚鰾上皮細胞(GSB)、鯉魚上皮瘤細胞(EPC)、錦鯉尾鰭細胞(KF)均由本實驗室保存；M199培養基、胎牛血清(FBS)，大腸桿菌DH5α(E.coliDH5α)感受態、大腸桿菌BL21(DE3)(E.coliBL21)感受態，PCR試劑盒，BamHⅠ酶、XholI酶，T4 Ligase和質粒提取試劑盒等均購自TaKaRa公司(中國大連)；膠回收試劑盒購自Omega公司(美國)；pET-32a(+)質粒由本實驗室保存；SDS-PAGE試劑盒、DAB顯色試劑盒等購自康為世紀有限公司(中國北京)。

1.2 實驗動物

體重約1.5～2.0 kg的雌性新西蘭兔3只，購自廣東省醫學實驗動物中心。

1.3 PCR擴增S9基因

根據GenBank(GU350746.1；HQ231205.1；KM 880073.1；KR180376.1；KU254574.1； KF712483.1；KC847328.1；KC201185.1)中GCRV Ⅱ型S9基因保守區域序列設計1對引物，上游引物：5′-GAT GGA TCC ATA GTC TCG GAA GCC TAC CAA-3′；下游引物：5′-ATA CTC GAG AGC ACG CGT CCA GTT ATT-3′(下劃線序列分別為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點)。每25 μL反應體系中加入2.5 μL 10×PCR reaction buffer，0.5 μL dNTP(10 mmol/L)，上、下游引物分別為0.5 μL，2 μL GCRV-HZ08株cDNA作為模版，LA Taq酶0.25 μL，ddH2O 18.75 μL；PCR反應按如下程序進行：95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，35個循環，最后72 ℃延伸10 min。膠回收試劑盒回收PCR產物。

1.4 構建pET-32a-S9原核表達載體

用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對PCR擴增的S9片段和表達載體pET-32a(+)進行雙酶切處理，37 ℃反應2 h，回收酶切后的目的片段和載體片段并連接，連接反應體系為T4 Ligase 1.5 μL，T4 Ligase buffer 1.5 μL，pET-32a(+)載體 5 μL，S9目的片段8 μL，16 ℃反應4 h。取E.coliDH5α將連接產物轉化入其中，提取重組質粒，經限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定正確后，送樣至廣州艾基生物技術有限公司進行測序驗證，經驗證正確的重組載體定名為pET-32a-S9。

1.5 VP6蛋白的誘導表達及表達形式分析

將上述鑒定正確的pET-32a-S9重組質粒轉化至E.coilBL21(DE3)中，篩選的陽性菌落挑至LB/Amp液體培養基置于恒溫搖床中擴大培養，測定光密度為(A600 nm=0.6)時，加入IPTG(終濃度1 mmol/L)誘導。誘導結束后收集菌體，超聲波(工作5 s，間歇10 s，功率250 W)裂解菌體，裂解菌體時注意保持低溫環境，收集破碎后的上清和沉淀，將上清和沉淀分別標記為溶液A、溶液B。SDS-PAGE分析目的蛋白的表達情況和表達形式，同時設立空載體pET-32a(+)作為陰性對照。

1.6 優化IPTG誘導條件

最優誘導表達條件采用棋盤法進行篩選。重組質粒pET-32a-S9轉化至E.coliBL21(DE3)后，挑取篩選的陽性克隆至LB/Amp液體培養基中，恒溫搖床上(200 r/min、37 ℃)培養12 h。在3 mL LB/Amp培養基中加入30 μL上述菌液，恒溫搖床(轉速、溫度同上)上繼續培養，至光密度(A600 nm分別設為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0，以實際測定為準)，分別加入IPTG(IPTG終濃度設為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mmol/L)誘導，繼續在恒溫搖床(轉速、溫度同上)中培養10 h，離心收集菌體，對重組目的蛋白的相對表達量進行分析。

1.7 目的蛋白純化

上述可溶性分析顯示重組蛋白為包涵體蛋白，棋盤法篩選最佳誘導條件為，在OD600 nm約為1.0，IPTG終濃度為1.6 mmol/L時，目的蛋白的表達量最高，可達70%以上。在最優誘導條件下將導入重組質粒的E.coliBL21(DE3)大量誘導表達，離心收集菌體，再加入PBS重懸，在冰上超聲波(工作5 s，間歇10 s，功率250 W)破碎菌體至溶液澄清。將破碎液離心，收集沉淀，按Ni-凝膠純化試劑盒(包涵體蛋白純化)說明書的步驟純化表達的重組VP6蛋白，收集洗脫液，保存備用。

1.8 多克隆抗體的制備

選取3只2月齡，質量為1.5～2.0 kg左右的健康雄性新西蘭兔，其中1只每次注射等量生理鹽水為陰性對照。每次將純化的重組蛋白經無菌生理鹽水稀釋后與佐劑按1∶1比例乳化，免疫方法為背部皮下多點注射，每只注射2 mL(抗原含量200 μg)，初次免疫使用完全弗氏佐劑，之后均使用弗氏不完全佐劑。第0周、第2周、第4周、第6周各免疫一次，并于第7周進行耳緣靜脈采血測定抗體效價。效價符合要求后，進行心臟采血，收集血清，-20 ℃保存備用。

1.9 間接ELISA檢測血清抗體效價

將pH 9.6的碳酸鹽緩沖液按1∶104稀釋純化的重組蛋白(50 ng/mL)作為包被液，包被96孔酶標板，每孔100 μL，置于4 ℃冰箱過夜；每孔滴加1% BSA 200 μL置于37 ℃封閉2 h；封閉結束后加入等梯度稀釋(1∶101、1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106、1∶107、1∶108、1∶109、1∶1010)的血清各100 μL， 37 ℃作用2 h；然后加入HRP標記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)100 μL，37 ℃作用1 h；以上每步反應結束后都用PBST緩沖液洗板3～5次，每次5 min；最后用TMB顯色試劑盒顯色，終止顯色用0.5 mol/L的H2SO4溶液。酶標儀上讀取A450 nm值(當A450 nm≥0.277，且大于陰性對照2.1倍時，判定為陽性)。對照組設置相應稀釋倍數的陰性血清。

1.10 Western blot分析

將純化的VP6重組蛋白、濃縮的GCRV HZ08、GZ1208、104、KHV、ISKNV、LBMV和SCRV病毒進行SDS-PAGE電泳，將分離的蛋白通過半干轉膜法轉移至NC膜上，于2%的BSA封閉液中室溫封閉2 h；一抗為1∶1 000稀釋的上述血清，37 ℃作用2 h；二抗為1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔IgG，37 ℃作用1 h；每次反應后均用TBST洗3～5次，每次5 min，最后用DAB顯色劑顯色并觀察結果。

1.11 間接免疫熒光試驗(IFA)

將GSB、EPC和KF細胞傳代至96孔細胞培養板中，待細胞長至單層鋪滿80%左右后，GSB細胞接種GCRV-HZ08、HuNan1307、GZ1208、HGDRV病毒，EPC細胞接種ISKNV、LBMV、SCRV病毒，KF細胞接種KHV病毒，設置未接種病毒的正常細胞作為陰性對照。攻毒5 d后，吸凈細胞培養板上的培養基，PBS(0.01 mol/L)洗滌3次，使用80%丙酮溶液固定，反應結束后吸凈細胞培養板上的丙酮，室溫下干燥；一抗為1∶1 000稀釋的兔抗VP6蛋白多克隆抗體，滴加100 μL，37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次，每次5 min；二抗為1∶50稀釋的FITC標記的羊抗兔IgG，滴加100 μL，37 ℃作用1 h，PBST洗滌3次，每次5 min，最后加入碘化丙啶染料，熒光倒置顯微鏡下觀察結果。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物鑒定

1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測結果(見圖1)顯示，在約750 bp處出現一條特異性條帶，與預期大小一致，陰性對照無任何條帶。

圖1 PCR擴增S9基因產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of amplification result for S9 gene PCR products1.陰性對照；2.S9基因PCR產物；M.DNA Marker DL 1000

2.2 雙酶切鑒定重組表達載體

使用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ對重組質粒pET-32a-S9進行雙酶切，經1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果(見圖2)顯示一大小約為750 bp的特異性條帶；經生工生物工程(上海)股份有限公司測序，結果顯示目的片段及閱讀框均正確。

2.3 VP6蛋白的表達和表達形式分析

SDS-PAGE電泳結果(見圖3)顯示，泳道1、2中未出現明顯表達的蛋白條帶，泳道4中約42 ku處出現一條明顯的重組蛋白條帶，與預期大小相符；泳道3中未見明顯的重組蛋白條帶，泳道5中重組蛋白含量較多。上清溶液A中重組蛋白含量很低，目的蛋白主要存在于溶液B中，說明目的蛋白主要以包涵體形式存在。

圖2 重組質粒pET-32a-S9雙酶切鑒定結果電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of digestion identification of pET-32a-S9 recombinant plasmid M.DNA Marker DL 15000；pET-S9.重組質粒 pET-32a-S9雙酶切產物

圖3 SDS-PAGE分析重組質粒pET-32a-S9 表達產物及其可溶性Fig.3 SDS-PAGE analysis results for the expression product of pET-32a-S9 recombinant protein and its the dissolubility of the recombinant protein M.低相對分子質量蛋白質marker；1.pET-32a(+) 空載體的誘導表達；2.pET-32a-S9重組載體未經 IPTG誘導對照；3.上清溶液A；4.pET-32a-S9 重組載體的誘導表達；5.沉淀溶液B

2.4 純化蛋白的鑒定

與泳道3中未純化的蛋白相比，泳道1中純化的VP6重組蛋白在約42 ku處條帶單一，無其他明顯雜帶；泳道2中的Ni柱流穿液在約42 ku處有少量條帶，蛋白純化效果較好(見圖4)。

圖4 S9基因編碼重組蛋白經Ni柱純化后 SDS-PAGE分析結果Fig.4 SDS-PAGE analysis results for the purified protein products of S9 gene coding recombinant protein1.純化的VP6重組蛋白；2.Ni柱流穿液； 3.未純化的菌體總蛋白；M.低相對分子質量蛋白質marker

2.5 血清抗體效價的檢測

使用間接ELISA方法測定血清效價，結果顯示該VP6重組蛋白多克隆抗體效價約為1∶105。

2.6 Western blot分析

Western blot結果(見圖5)顯示，加入純化的VP6蛋白的泳道中，約42 ku處出現一條特異性條帶；加入純化的HZ08株的泳道中，約48 ku處出現一條特異性條帶；而加入GZ1208、HGDRV、ISKNV、LBMV、SCRV、KHV病毒的孔道中未出現條帶。重組蛋白和GCRV Ⅱ型毒株能與制備的多抗血清特異結合，其他病毒與該多抗血清無特異性反應，表明該多克隆抗體特異性高。

圖5 Western blot分析VP6蛋白抗血清特性Fig.5 Western blot appraise the peculiarity of serum antibody against VP6 protein1.KHV病毒；2.ISKNV病毒；3.LBMV病毒； 4.SCRV病毒；5.HGDRV病毒；6.GCRV-GZ1208 病毒；7.VP6重組蛋白；8.純化的HZ08毒株； M.低分子質量蛋白質marker

2.7 間接免疫熒光分析

間接免疫熒光實驗結果(見圖6)顯示，感染GCRV-HuNan1307株和HZ08株的GSB細胞產生特異性的綠色熒光信號，而感染GZ1208、HGDRV毒株的GSB細胞以及未感染病毒的正常GSB細胞中觀察不到熒光信號；感染ISKNV、LBMV、SCRV毒株的EPC細胞和感染KHV毒株的KF細胞中均未見到熒光信號。表明制備的多克隆抗體能特異性識別GCRV Ⅱ型毒株，而不能識別GCRV Ⅰ型和Ⅲ型以及其它病毒。

圖6 間接免疫熒光分析VP6蛋白抗血清特性Fig.6 IFA identification of the polyclonal antibody1.感染HuNan1307株的GSB細胞；2.感染 HZ08株的GSB細胞；3.未感染病毒的正常GSB 細胞對照；4.感染GZ1208的GSB細胞；5.感染 HGDRV的GSB細胞；6.感染ISKNV的EPC細胞； 7.感染LBMV的EPC細胞；8.感染SCRV的EPC 細胞；9.感染KHV的KF細胞

3 討論

VP6蛋白參與GCRV病毒粒子內衣殼蛋白的構成，能連接內衣殼和外衣殼，與哺乳動物呼腸孤病毒的δ2蛋白功能相似[5]。呼腸病毒科包括輪狀病毒屬和水生動物呼腸孤病毒屬，研究人員在對輪狀病毒VP6蛋白的研究中發現，VP6蛋白具有高度的免疫原性，但不誘導中和抗體，針對VP6蛋白的抗體在感染輪狀病毒的實驗組中具有高度的交叉反應性，推測VP6抗體可提供潛在的特異性免疫保護[12]。此外，在一些針對草魚出血病疫苗研發的研究中，以VP6蛋白作為免疫原可以提供高水平的免疫保護[13-15]，因此，VP6蛋白可以認為是一種用于免疫測定的良好靶蛋白[16]，可以作為制備草魚出血病基因工程疫苗的候選蛋白。Fang等[17]成功在昆蟲細胞(sf9)中融合表達了GCRV VP6蛋白與熒光增強蛋白(EGFP)；周勇等[18]構建了GCRV VP6蛋白與綠色熒光蛋白、大腸桿菌LTB亞基植物融合表達載體，這些研究結果為研發草魚出血病可飼性轉基因動、植物疫苗提供了新思路。Zhou等[19,20]使用GCRV Ⅲ型(HGDRV株)VP6蛋白制備的小鼠多克隆抗體具有高特異性；制備的GCRV Ⅲ型(HGDRV株)VP6蛋白DNA疫苗，在免疫應答早期的效果評價中，該DNA疫苗能夠在一定程度上抑制GCRV的增殖以及該病毒誘導的細胞病變效應，顯示了良好的免疫效果。

本實驗以GCRV Ⅱ型代表毒株GCRV-HZ08的S9基因為研究對象，擴增S9基因，并成功構建pET-32a-S9原核表達載體，蛋白表達形式分析顯示該VP6蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體蛋白。測定使用該VP6蛋白制備的多克隆抗體效價，結果顯示制得的多克隆抗體效價約為1∶105，遠高于GCRV Ⅱ型(GCRV-HZ08株)S6片段表達的VP4蛋白制備的多克隆抗體效價(約1∶8 000)[21]，但比HZ08株S10基因片段表達的蛋白制備的多克隆抗體效價(約1∶106)略低[22]。S9片段編碼的蛋白誘導制備的抗體效價較高，說明該VP6蛋白免疫原性較好，可以作為研制草魚出血病基因工程疫苗的候選蛋白。經Western blot和IFA分析可知，制備的多克隆抗體能特異性識別GCRV Ⅱ型毒株，而不能識別GCRV Ⅰ型和Ⅲ型以及其它病毒，表明該多克隆抗體具有較高的特異性。本實驗結果為S9基因片段編碼蛋白功能的深入研究、抗原表位分析、基因工程疫苗的研制以及草魚出血病的防治奠定了基礎；同時，結合Fang、周勇等[17,18]的研究也為我們開發草魚出血病可飼性轉基因動、植物疫苗的研究提供了新思路。

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